Биотехнологические методы изучения полиморфизма гена гормона роста

Категория: Общая биология.

Реферат. Темпы роста и состав тела являются двумя важными характеристиками в производстве животноводческой продукции.  Современное состояние отрасли овцеводства требует высоких темпов роста и большой процент выхода постного мяса, вместе с эффективной конверсией корма. Гормон роста GН, соматотропный гормон, обладает широким спектром биологического действия, влияя на все клетки организма. Он усиливает биосинтез белка, ДНК, РНК и гликогена и в то же время способствует мобилизации жиров из депо и распаду высших жирных кислот и глюкозы в тканях. Помимо активации анаболических процессов, сопровождаю­щихся увеличением размеров тела, стимуляцией роста скелета, соматотропин координирует и регулирует скорость протекания обменных процессов. Целью исследований стало изучение полиморфизма гена GН на продуктивные качества овец, разводимых в Ростовской области. Молекулярно-генетические исследования полиморфизма гена GН проводили методом ПЦР-ПДРФ (полимеразной цепной реакции – полиморфизм длин рестрикционных фрагментов). Мясные качества учитывали по результатам контрольного убоя баранчиков в возрасте 10 месяцев (n = 50) по следующим показателям: предубойная масса, кг; масса мякоти (полутуши), кг; убойная масса, кг; убойный выход, %; масса внутренних органов (селезенка, легкие, сердце, печень, почки), г. Полученные результаты показали перспективность гена в качестве маркера откормочной и мясной продуктивности овец и дальнейшие исследования в данном направлении позволят разработать селекционные программы по совершенствованию сальской породы овец с учетом полиморфизма гена GН.

Ключевые слова: биотехнологические методы, овцы, GН, HaeIII, полиморфизм, мясные качества.

В настоящее время возрастает интерес к технологиям, основанным на использовании ДНК-маркеров, которые находят широкое применение в национальных селекционных программах ряда стран с развитым животноводством и оказывают значительное воздействие на улучшение состава туши, качество мяса и эффективность производства мяса [2, 4].

Все большую популярность приобретают генетические маркеры, взаимосвязанные с генами (гены-кандидаты), белковый продукт которых играет значительную роль в формировании или регуляции биохимических и физиологических процессов [1, 5].

Сам ген при этом должен обладать различными аллельными вариантами (полиморфизмом), которые связаны с вариативностью уровня продуктивности [7].

Среди прочих одним из перспективных генов-кандидатов является ген гормона роста (GH). Гормон роста, соматотропный гормон, обладает широким спектром биологического действия, влияя на все клетки организма. Он усиливает биосинтез белка, ДНК, РНК и гликогена и в то же время способствует мобилизации жиров из депо и распаду высших жирных кислот и глюкозы в тканях. Помимо активации анаболических процессов, сопровождающихся увеличением размеров тела, стимуляцией роста скелета, соматотропин координирует и регулирует скорость протекания обменных процессов [7].

Гормон роста – белок с молекулярной массой около 22 000, его полипептидная цепь состоит из 191 аминокислотного остатка. Полиморфизм гена, расположенного в третьем экзоне, может быть определен методом ­ПЦР-ПДРФ с использованием эндонуклеазы рестрикции HaeIII.

Мутация в регуляторной области гена GH может влиять на уровень транскрипции и привести к повышению концентрации GH в плазме. Ученые определили полиморфизм в регуляторной области гена GH, но не выявили прямую причинно-следственную связь между этим полиморфизмом и ростом концентрации GH в плазме [8, 9].

Исследованиями 1990-х гг. установлена связь полиморфизма гена гормона роста с мясными качествами в различных европейских породах овец, что позволило рассматривать ген GH в качестве маркера мясной продуктивности [6].

В связи с этим целью нашей работы было изучение полиморфизма гена GH и определение ассоциативных связей с росто-весовыми и мясными признаками у сальской породы овец, разводимых в Ростовской ­области.

Методика исследований

Материалом исследований служили овцы сальской породы (n = 84), разводимые в Ростовской области Российской Федерации. Для проведения молекулярно-генетических исследований у животных были отобраны образцы ткани с ушной раковины площадью 1 см². ДНК выделяли с применением набора реагентов DIAtom DNA Prep 100 (ООО «НПФ Генлаб», Россия). Анализ проводили методом ПЦР-ПДРФ (полимеразной цепной реакции – полиморфизм длин рестрикционных фрагментов).

Условия ПЦР: предварительная денатурация при 95 °С – 5 минут и далее 33 цикла: 95 °С – 45 с, 60 °С – 45 с, 72 °С – 45 с; заключительный синтез при 72 °С – 10 минут. Рестрикцию амплифицированного фрагмента проводили эндонуклеазой HaeIII. Наличие 10 сайтов рестрикции соответствовало аллелю А, наличие 11 сайтов – аллелю В. Размер полученных рестрикционных фрагментов определяли методом электрофореза в 4%-ном агарозном геле в присутствии бромистого ­этидия.

По результатам молекулярно-генетического анализа устанавливали наличие и частоту аллелей и генотипов. Влияние генотипов гена GH на скорость роста учитывали у баранчиков (n = 84) по следующим показателям: вес при рождении, кг; вес при отъеме в 2 месяца, кг; среднесуточный прирост веса животного со дня рождения до 2 месяцев, кг. Мясные качества учитывали по результатам контрольного убоя баранчиков в возрасте 10 месяцев (n = 50) по следующим показателям: предубойная масса, кг; масса мякоти (полутуши), кг; убойная масса, кг; убойный выход, %; масса внутренних органов (селезенка, легкие, сердце, печень, почки), г. Все исследуемые животные были одного года рождения и содержались в одинаковых условиях.

Результаты и обсуждение

Овцы породы сальская были выведены в Сальском районе Ростовской области, на знаменитом конезаводе им. С. М. Буденного. Начиная с 1930-х гг., перед селекционерами встала задача по выведению новой породы овец шерстного типа, адаптированной к очень засушливым условиям Сальских степей Ростовской области и близлежащих регионов, которая к тому же обладала бы как крупными размерами, так и высокими показателями по настригу тонкой шерсти.

Для реализации этих планов было решено взять за основу в качестве материнской линии местных Ростовских овец пород мазаевская и новокавказский меринос, имевших множество пороков, пониженную продуктивность, недостатки в экстерьере, довольно слабую конституцию и довольно низкую жизнеспособность. Средняя живая масса баранов местной популяции овец составляла всего ­55–65 кг, маток – порядка ­35–40 кг, при этом средний настриг шерсти с баранов был в пределах 8–9 кг, а у маток – ­4,5–5 кг при выходе мытого волокна до ­25–30%. Ярок местных породы случали в возрасте 2,5 лет, от каждой из 100 маток получали не более 100 ягнят.

В качестве отцовской линии были выбраны бараны американской породы рамбулье. По своим конституционально-продуктивным качествам сальская порода овец очень похожа на советских мериносов: они такие же крупные, с крепкой конституцией, обладают характерной небольшой складчатостью и вполне удовлетворительным телосложением. У сальских овец довольно широкая грудь, относительно длинное туловище, прямая спина. На шее одна-две поперечные складки и одна большая продольная, внизу они завершаются так называе­мым фартуком, бурдой. Сальская порода овец относится к шерстному, тонкорунному направлению продуктивности. Фактически сальские овцы получились идеально подходящими к различным условиям содержания и кормления. Они обладают прекрасным иммунитетом, отличной выносливостью, способны совершать длительные переходы, приспособлены к тебеневке и использованию бедных, низкопродуктивных пастбищных угодий.

После многолетней селекции путем воспроизводительного скрещивания овец местных мериносов с баранами американской породы рамбулье с жестким отбором среди помесных животных лучших представителей желательного типа и разведением их «в себе» в 1950 г. работа была успешно завершена и сальская порода овец получила официальный статус новой породы. Живой вес баранов сальской породы находится в пределах 80–95 кг, а маток соответственно – 45–50 кг. Масса туши после откорма у взрослых сальских валухов достигает 30–33 кг, у 6–7-месячных сальских валушков – около 14–16 кг. Убойный выход у взрослых животных составляет не менее 50%, у молодых – в районе 43%. Шерсть у сальских овец белого цвета, длинная, порядка 7,5–8 см, хорошо уравненная, крепкая, с сильной извитостью. Жиропот светлый, средне стойкий. Руно штапельного строения, закрытое. Штапель в основном цилиндрический. Извитость ясно выражена. Настриг шерсти с баранов сальской породы достигает 12–14 кг, максимально – 17 кг, у овцематок – не менее 5,5–6,5 кг, порою – 8 кг. Тонина шерсти у сальских овец, как правило, 64 класса, реже – 70, у сальских баранов в пределах 60–64 классов. Выход чистой шерсти доходит до 42%. Плодовитость овец сальской породы достаточно высокая: на 100 маток приходится порядка 120–140 ягнят.

Основное ядро овец сальской породы располагается в Ростовской области. Изначально сальские овцы создавались в расчете на специфические условия засушливых Сальских степей, и вполне логично, что лучшее поголовье сальской породы овец в нынешние дни находится в племрепродукторе «Северный», что в Рос­товской области.

К огромному сожалению, в ны­нешние времена сальская поро­да овец стала сдавать позиции, так как саль­ских маток нередко стали скрещивать с ­более продуктивными манычскими тонкорунными мериносами из близ лежащих регионов.

Неоспоримыми достоинствами сальских овец являются их высокая неприхотливость, выносливость и прекрасная длинная, тонкая шерсть высокого качества с хорошим выходом чистой шерсти при настриге.

На первом этапе в результате проведения молекулярно-генетических исследований у овец сальской породы были определены аллельные варианты гена GH (рис. 1) и установлены генотипы, представленные фрагментами: 277-, 202-, 110-, 100-, 94-, 68-, 49-, 22- , 8- и 4 н. п. – генотип АА; 256-, 202-, 110-, 100-, 94-, 68-, 49-, 22-, 21-, 8- и 4 н. п. – генотип ВВ и 277-, 256-, 202-, 110-, 100-, 94-, 68-, 49-, ­22-, 21-, 8- и 4 н. п. – генотип АВ.

Частота встречаемости трех генотипов – АА, АВ и ВВ установлена в соотношении 57, 36 и 7% соответственно (табл. 1). В целом у сальской породы овец наибольшую частоту имел аллель А и гомозиготный генотип АА.

Таблица 1 – Частота аллелей и генотипов гена GH овец сальской породы

Проведение дальнейших исследований по изучению связи аллельных вариантов гена GH со скоростью роста показало, что наличие гетерозиготного генотипа АВ у баранчиков сальской породы оказывает положительное влияние на темпы роста молодняка. Живая масса при отъеме баранчиков с генотипом АВ превосходила массу аналогов с генотипами АА и ВВ на 0,92 и 1,42 кг (р ≤ 0,05) соответственно (табл. 2). Среднесуточный прирост у баранчиков с гетерозиготным генотипом АВ также был больше на 25,3 и 25,9 г (р ≤ 0,05) по сравнению со сверстниками с генотипами АА и ВВ.

Таблица 2 – Динамика роста овец сальской породы различных генотипов по гену GH

*р ≤ 0,05.

Результаты контрольного убоя (табл. 3) показали, что наилучшую мясную продуктивность имели баранчики генотипа АВ, которые достоверно превосходили аналогов генотипа АА практически по всем анализируемым признакам. Предубойная живая масса у баранчиков генотипа АВ была больше на 10,65 кг (р ≤ 0,01), а также от них были получены большая масса туши на 4,97 кг (р ≤ 0,01) и масса мякоти – на 1,83 кг (р ≤ 0,05). Убойная масса и убойный выход у баранчиков генотипа АВ превышали на 4,83 кг и 2,04% соответственно данным показателям у баранчиков генотипа АА. Дополнительно была проведена оценка массы внутренних органов. В результате было определено, что наличие генотипа АВ у баранчиков связано с большей массой сердца и почек на 75,21 и 75,44 г (р ≤ 0,05) соответственно. Достоверных различий по другим признакам (масса селезенки, легких и печени) установлено не было.

Таким образом, результаты ДНК-диагностики полиморфизма гена GH показали, что лучшую живую массу при отъеме в 2 месяца, среднесуточный прирост от рождения до отъема, а также предубойную массу и мясную продуктивность имели овцы генотипа АВ.

В проведенных нами исследованиях у овец сальской породы гетерозиготный генотип также связан с лучшими среднесуточными приростами с рождения и до отъема в два месяца.

Подводя итог данной работы, нужно отметить, что впервые получены результаты полиморфизма гена GH у овец сальской породы, разводимых в Ростовской области (Россия), и выявлены достоверные ассоциации между генотипами гена GH и селекционно-ценными признаками овец сальской породы.

Полученные результаты показали перспективность гена в качестве маркера откормочной и мясной продуктивности овец, и дальнейшие исследования в данном направлении позволят разработать селекционные программы по совершенствованию сальской породы овец с учетом полиморфизма гена GH.

Все это очередной раз подтверждает необходимость поиска и изучения ДНК-маркеров, ассо­циированных с продуктивными качествами овец, для большей эффективности селекционных работ и повышения рентабельности отрасли овцеводства.

Работа выполнена за счет средств гранта Президента РФ для государственной поддержки молодых российских ученых-кандидатов наук – договор № 14.W01.17.1030-МК от 22.02.2017 г.

ЛИТЕРАТУРА

1. Колосов Ю. А. Использование генофонда мериносовых овец отечественной и импортной селекции для совершенствования местных мериносов // Овцы, козы, шерстное дело. – 2012. – № 4.– С. 13–16.
2. Широкова Н. В. Генетическое детерминирование плодовитости овец // Молодой ученый. – 2013. – № 6. – С. 785–787.
3. Effect of GH gene polymorphisms on biometric traits in Makooei sheep / A. Hajihosseinlo, A. Semsarnejad, E. Abollow, F. Hashrafi, M. Negahdary [Электронный ресурс] // Annals of Biological Research. – 2013. – No. 4(6). – Pp. 351–355. – Режим доступа: http://scholarsresearchlibrary.com/ABR-vol4-iss6/ABR-2013-4-6-351-355.pdf.
4. Influence of Various Bio-Stimu­lants on the Biochemical and He­matological Parameters in Porcine Blood Plasma / N. Karagodina, Yu. Kolosov, A. Usatov, S. Bakoev, A. Kolosov, M. Leonova, N.Shirokova, A. Svyatogorova, L. Getmantseva // World Applied Sciences Journal. – 2014. – No. 30(6). – Pp. 723–726.
5. Kolosov Yu., Getmantseva L., Shirockova N. Sheep Breeding Resources in Rostov Region // World Applied Sciences Journal. – 2013. – No. 23(10). – Pр. 1322–1324.
6. Polymorphism of the GDF9 Gene in Russian Sheep Breeds / Yu. A. Kolosov, L. V. Getmantseva, N. V. Shirockova, A. Klimenko, S. Yu. Bakoev [et al.] // Journal Cytol Histol. – 2015. – No. 6. – P. 305.
7. Malewa A. D. Sifat kualitatif eksternal domba Donggala pada tiga lokasi di Sulawesi Tengah // Agrisains. – 2014. – No. 10(2). – Pp. 101–109.
8. Mihailov N. V., Getmantseva L. V. Association polymorphism in the POU1F1/MspI, PRLR/AluI и ESR1/PvuII gene with reproductive traits in Pigs // European Applied Sciences. – 2013. – No. 2. – Pp. 7–10.
9. Noor R. R., Djajanegara A., Schüler L. Selection to improve birth and weaning weiGHt of Javanese fat tailed sheep // Arch. Tierz. – 2001.

Метки: Общая биология

• Назад
• Вперед