СХЕМА ВЫДЕЛЕНИЯ И СЕЛЕКЦИИ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ КОНСОРЦИУМА СТАРТЕРНОЙ ЗАКВАСКИ, УСКОРЯЮЩЕЙ КОМПОСТИРОВАНИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ ОТХОДОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ПРЕДПРИЯТИЙ

Категория: Общая биология.

Реферат. Статья посвящена выделению бактериальных штаммов бактерий Bifidobacterium longum, Lactobacillus acidophilus, Bacillus subtillis из почвы, сточных вод, навоза сельскохозяйственных животных и помета птиц, компоста, а также кисломолочных продуктов. Целью работы стали выделение штаммов бактерий видов Bifidobacterium longum, Lactobacillus acidophilus, Bacillus subtillis из фекалий поросят, кисломолочных продуктов, помета птиц и навоза свиноводческих предприятий, навозохранилищ и сточных вод и последующий их селективный отбор по биологическим свойствам и отсутствию межвидового антагонизма. Всего исследовано 110 проб, и с использованием специфичных схем и сред выделено 100 штаммов бактерий, перспективных для использования в качестве стартерной закваски ускоряющей компостирование органических отходов сельскохозяйственных предприятий. В свою очередь, в дальнейшем при исследовании ферментативных и биологических свойств определена принадлежность исследуемых штаммов к бактериям видов Bifidobacterium longum, Lactobacillus acidophilus, Bacillus subtillis. Частота выделения для бактерий Lactobacillus acidophilus составила 3,6%. Штаммов бактерий Bifidobacterium longum – 2,7%, бактерий Bacillus subtillis – 8,1%. Штаммы Lactobacillus acidophilus 53, Lactobacillus acidophilus 91, Bifidobacterium longum 108, Bifidobacterium longum 89, Bacillus subtillis 32, Bacillus subtillis 49 обладали типичными ферментативными и биологическими свойствами, антагонизм в отношении друг друга отсутствовал.

Ключевые слова: аэробное компостирование, Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacillus, селекция, антагонизм.

Отмечено и зафиксировано, что в ряде европейских стран, особенно в России, возрастает нагрузка на почву, связанная с антропогенным воздействием на экологию. Внесение высоких доз минеральных удобрений, главным образом азотных, фосфорных и т. д., несомненно благоприятно сказывается на количестве урожая сельскохозяйственных культур, при этом, однако, снижаются качественные характеристики, такие как сроки хранения, органолептические свойства и т. д. Почвенные микроорганизмы чрезвычайно чувствительны к внесению антропогенных загрязнителей в виде минеральных веществ. Внесение органических удобрений точечно под возделываемые культуры способно восстанавливать баланс почвенной микрофлоры. Основным источником органических удобрений могут служить переработанный навоз сельскохозяйственных животных и помет птиц.

Аэробное компостирование органических отходов животноводческих предприятий – оптимальное решение для сельского хозяйства.

Одним из эффективных, энергетически выгодным и экономически обоснованным является способ компостирования навоза с применением так называемых эффективных микроорганизмов [4]. При внесении стартерных культур бактерий сроки компостирования сокращаются от нескольких месяцев до 7–10 дней. Стартерные культуры должны отвечать, по нашему мнению, ряду требований:

1. Быть безопасными для людей, животных, растений (Bifidobacterium longum, Lactobacillus acidophilus, Bacillus subtillis).

2. Вызывать деструкцию сложных органических комплексов на начальном этапе компостирования (Bifidobacterium longum, Lactobacillus acidophilus, Bacillus subtillis).

3. Проявлять антагонизм к патогенной микрофлоре животных и человека, а также возбудителям болезней растений (Bifidobacterium longum, Lactobacillus acidophilus, Bacillus subtillis).

4. Снижать титр к концу процесса компостирования (Bifidobacterium longum, Lactobacillus acidophilus) и обладать синергизмом по отношению к растениям, в том числе формировать симбиотические связи (Bacillus subtillis).

5. Быть продуцентами деструктивных ферментов, благодаря которым становятся доступными многие сложные вещества навоза, такие как целлюлоза, крахмал, липиды и т. д.

В результате проведения патентного поиска и анализа отечественной и зарубежной литературы нами установлено, что наиболее часто встречающимися бактериями в стартерных заквасках при аэробном компостировании навоза являются представители родов Bacillus sp. и Lactobacillus sp. Зарубежные технологии предполагают использование селективно отобранных штаммов следующих видов бактерий – Bif. longum, L. acidophilus, Bac. subtillis. Как известно аборигенная микрофлора наиболее оптимально адаптируется к условиям окружающей среды и утилизируемым субстратам. Нами предпринята попытка выделить аборигенные штаммы бактерий видов Bif. longum, L. acidophilus, Bac. subtillis, изучить их основные ферментативные свойства (позволяющие проводить их дифференциацию), отношение к окраске по Граму и способность к росту при 45 °C.

При разработке консорциума стартерной закваски для аэробного компостирования обнаружены данные, касающиеся антагонизма указанных видов бактерий. Особенно часто в литературных обзорах встречаются сведения о возможном антагонизме и межвидовом взаимном ингибировании у представителей Bif. longum и Bac. subtillis.

Bif. longum – бактерии, которые приспособились к низкой pH среды, во влажных богатых органикой субстратах и приобрели механизмы адаптации, в отличие от других представителей Bifidobacterium sp., к кислороду. Все описанные на данный момент виды бифидобактерий распределены по следующим основным экологическим нишам: 1 – кишечник человека; 2 – полость рта; 3 – вагинальная полость; 4 – желудочно-кишечный тракт животных; 5 – кишечник насекомых; 6 – кисломолочные продукты и сточные воды [2, с.62–64; 3,
с. 279–283; 18, с. 1–8].

Многие авторы отмечают проявление устойчивости к кислой среде у Bif. longum и Bif. animalis [14, с. 146–154]. Механизмом поддержания постоянного внутреннего значения pH у бифидобактерий является дезаминирование аминокислот с разветвленной цепью [15, с. 6450–6459]. Высокие внутриклеточные концентрации NH4+, отмеченные при их росте в кислой среде, помогают им создать защиту от внешнего изменения уровня pH. Одним из наиболее изученных видов бифидобактерий является Bif. longum. Этот вид бифидобактерий отличается повышенной устойчивостью к желчным кислотам и высоким концентрациям хлорида натрия. Bif. longum, по данным исследователей, эффективно утилизируют аммиак и могут использовать соли аммония для нитрификации. Кроме того, Bif. longum образуют бактериоцины и сравнительно рано отмирают при повышении температуры свыше 40 ºC, а также при последующей ­аэрации. Bif. longum стабильно ферментирует субстрат на ранних этапах компостирования при сравнительно низком уровне кислорода во влажном навозе. При этом утилизируются сложные олигосахариды для запуска каскада реакций. Штаммы Bif. longum подкисляют среду, поэтому его начали использовать для изготовления бактериальных препаратов и кисломолочных продуктов [6, с. 93–94; 17, с. 461–469].

Бактерии рода Lactobacillus sp. встречаются во многих экологических нишах, отвечающих их метаболизму. Такие экологические ниши, как почва, эпифитная микрофлора, различные биотопы организма человека и животных, обеспечивают дефицит кислорода и высокую концентрацию питательных веществ. Кислотоустойчивость этих бактерий, как и способность продуцировать большое количество молочной кислоты, можно рассматривать как эволюционно сложившийся механизм приспособления к выживанию в сложных условиях и конкуренции [13, с. 205].

Бактериоцины лактобактерий имеют узконаправленное избирательное действие, однако синтезируют несколько антимикробных субстанций, принадлежащих к разным классам и обладающих разным спектром [7, с. 114–116]. L. acidophilus выдерживают более поздние стадии компостирования органических отходов и размножаются при 45 °C. Важнейшей физиологической особенностью лактобактерий является их кислотоустойчивость. L. acidophilus увеличивают содержание азота в среде, что важно для второй и третьей стадий компостирования [5, с. 346].

Многие зарубежные ученые отмечают, что применение непатогенных почвенных бактерий, особенно из рода Bacillus, живущих на корнях растений, способствует не только повышению урожайности, но и получению растительной продукции с необходимым уровнем содержания жизненно важных для животных и человека микроэлементов [8, с. 4081–4085]. Основные преимущества использования биопрепаратов заключаются в экологизации сельского хозяйства.

Бактерии, относящиеся к роду Bacillus, в частности штаммы Bac. subtilis, являются эффективными для биологической борьбы со многими болезнями растений [9, с. 95–109; 11, с. 169–171; 12, с. 99–104]. Обладая спектром ферментов-деструкторов, бактерии Bac. subtilis выживают при экстремальных стадиях компостирования (60–70 °C) и образуют симбиотические связи с широким спектром видов растений.

Целью нашей работы стали выделение штаммов бактерий видов Bif. longum, L. acidophilus, Bac. subtillis из фекалий поросят, кисломолочных продуктов, помета птиц и навоза ­свиноводческих предприятий, а также из навозохранилищ и сточных вод и последующий их селективный отбор по биологическим свойствам и отсутствию межвидового антагонизма.

Выделения бактерий Lactobacillus sp., Bifidobacterium sp., Bacillus sp. из различных объектов
внешней среды

С целью бактериологического исследования использовали образцы почвы, фекалий и компоста в объеме 10 г засевали в колбы, содержащие 100 мл жидких сред накопления, спе­цифичных для каждого искомого рода. Образцы сточных вод и кисломолочных продуктов засевали в объеме 10 мл в указанные среды. В качестве среды накопления для Lactobacillus sp. нами выбрана жидкая среда MRS (HiMedia) обладающая селективными свойствами, для Bifidobacterium sp. – жидкая среда для бифидобактерий с наслоением вазелинового масла после автоклавирования. С целью первичного выделения бактерий рода Bacillus sp. была выбрана схема в модификации Д. А. Васильева (2003 г.) Пробы засевали в ГРМ-бульон (Оболенск) с содержанием 7% хлорида натрия и прогревали при 80 ºC в течение 15 мин. Засеянные среды культивировали при температуре 37 ºC в течение 72 часов. Через указанное время из колб, в которых наблюдался рост бактериальной массы, проводили рассев на плотные селективные среды с целью получения чистых культур. Из среды для лактобактерий рассев проводили на плотную среду в модификации А. И. Нетрусова. Пассеровали отдельностоящие колонии не менее трех раз и при получении чистых культур проводили дальнейшую идентификацию. Бифидобактерии пересевали на среду с мупироцином и культивировали в анаэробных условиях для получения чистой культуры не менее трех раз. Высев из среды с предполагаемыми бактериями рода Bacillus sp. рассевали по методу Дригальского на ГРМ-агар (Оболенск).

Выделенным штаммам присваивали названия, соответствующие номеру пробы и названию рода. Таким образом, исследовано 110 проб и выделено 100 штаммов, из которых 75 отнесено к бактериям рода Bacillus sp., 11 – к роду Bifidobacterium sp. и ­14 – к роду Lactobacillus sp. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Результаты выделения бактерий Lactobacillus sp., Bifidobacterium sp., Bacillus sp. из различных объектов внешней среды с использованием селективных сред и факторов

Примечание: номер штамма соответствует номеру пробы, буква – предполагаемому, искомому роду.

Типирование выделенных штаммов на основании биологических свойств

Дальнейшим этапом работы было исследование ферментативных свойств, восприимчивость к окраске по Граму и термотолерантность к температуре 45 ºC выделенных штаммов. Для этого мы использовали данные справочника Берджи и выбрали наиболее специфичные тесты для бактерий видов Bif. longum (без учета подвидовых особенностей штаммов), L. acidophilus, Bac. subtillis [10, с. 73, 484].

Целлюлозолитическую активность выделенных изолятов определяли по модифицированной методике [16, с. 579–580].

Взаимодействие красителя конго красного с некоторыми полисахаридами образует комплекс красного цвета, который разрушается действием β-глюконаз. Модифицированный ­метод определения целлюлозолитической активности бактериальной культуры заключается в том, что в лунки агаризованной среды, содержащей порошок фильтровальной бумаги, вносили культуральную жидкость тестируемых культр. Через 24 ч культивирования при 37 ºC лотки со средой обрабатывали красителем конго красным. После окрашивания поверхности среды вокруг лунок на красном фоне образовывались неокрашенные светло-розовые зоны в форме колец, размер которых зависел от активности синтезируемых культурой ферментов (чем больше диаметр зоны, тем выше целлюлозолитическая активность). Бифидобактерии в чашках Петри  культивировали в анаэростате.

Липолитическую активность определяли на средах с трибутирином. Для этого в среду для бифидобактерий, MRS и ГРМ-бульон вносили 2% трибутирина и 1,5% агар-агара. Трибутирин – жир, в состав которого входят три молекулы масляной кислоты. Вокруг колоний бактерий, проявляющих липолитическую активность на мутной среде, образовывалась зона просветления (в результате деградации трибутирина). Через 48 ч культивирования при 37 ºC проводили учет результатов. Бифидобактерии в чашках культивировали в анаэростате.

Протеолитическую активность определяли, используя желатиновый тест. Для этого в среду для бифидобактерий, MRS и ГРМ-бульон вносили желатин до концентрации 12%. В пробирки с бифидобактериями наслаивали стерильное вазелиновое масло. Через 24 ч культивирования при 37 ºC проводили учет результатов по стандартной методике.

Для определения амилазной активности в среду для бифидобактерий, MRS и ГРМ-бульон вносили 1,5% агар-агара и 200 гр/л картофельного крахмала. Далее уколом стерильным шприцем в плотный агар вносили исследуемую культуру. Через 24 ч культивирования при температуре 37 ºC поверхность чашек Петри обрабатывали раствором Люголя. При положительном результате зоны вокруг укола были более светлые.

Прочие идентифицирующие параметры: окраску по Граму, ка­талазную активность, анализ роста при 45 ºC, способность к фермен­тации L-арабинозы, образованию газа из глюкозы, утилизацию мальтозы, утилизации мочевины – определяли стандартными методами, на которых останавливаться подробно не будем.

Результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Исследование ферментативных свойств, восприимчивость к окраске по Граму и термотолерантность к температуре 45 ºC выделенных штаммов

Примечание: 1 – окраска по Граму; 2 – целлюлозолитическая активность; 3 – протеолитическая активность; 4 – амилолитическая активность, 5 – липолитическая активность; 6 – рост при 45 ºC; 7 – утилизация L-арабинозы; 8 – утилизация мальтозы; 9 – газ из глюкозы; 10 – утилизация мочевины; «+» – наличие признака; «–» – отсутствие признака.

Исследование межвидового антагонизма выделенных штаммов

Существующие на сегодня методы определения антагонистической активности делятся на две группы: in vitro и in vivo. На первых этапах исследования применяют в основном методы in vitro.

Тест-культуру L. acidophilus за­севали в пробирки в объеме 1% суточной культуральной взвеси в оптимальную для нее жидкую питательную среду MRS объемом 8 мл, к которой добавляли 2 мл бесклеточной культуральной жидкости Bac. subtillis. Параллельно ставили контроль. Про­бирки инкубировали при 37 ºC в течение 24 часов. Оценку степени антагонистического действия определяли по угнетению роста высевом разведений L. acidophilus на плотную среду MRS с последующим подсчетом КОЕ и сравнением с контролем [1, с. 135]. За ингибирующий эффект принимали снижение КОЕ L. acidophilus более чем на два порядка. Далее повторяли данную методику, но в качестве тест-объекта использовали штаммы Bac. subtillis, к которым вносили бесклеточную культуральную жидкость L. acidophilus. Аналогичным образом определяли антагонизм между штаммами Bif. longum, L. acidophilus и Bac. subtillis. Результаты представлены в таблицах 3, 4, 5.

Выводы

Из 110 проб почвы, сточных вод, навоза сельскохозяйственных животных и помета птиц, компоста, а также кисломолочных продуктов выделено 100 штаммов бактерий, перспективных для использования в качестве стартерной закваски, ускоряющей компостирование органических отходов сельскохозяйственных предприятий. Частота выделения для бактерий L. acidophilus составила 3,6%; штаммов бактерий Bif. longum – 2,7%; бактерий Bac. subtillis – 8,1%. Штаммы L. acidophilus 53, L. acidophilus 91, Bif. longum 108, Bif. longum 89, Bac. subtillis 32, Bac. subtillis 49 обладали типичными ферментативными и биологическими свойствами, антагонизм в отношении друг друга отсутствовал.

Литература

1. Банникова Л. А. Селекция молочнокислых бактерий и их применение в молочной промышленности. – М. : Пищевая промышленность, 1975. – 256 с.
2. Бондаренко В. М. По поводу нового подхода к классификации фармакопейных лекарственных пробиотических препаратов, биологически активных добавок к пище и продуктов функционального питания //
   Фарматека. – 2007. – № 2. –
   С. 62–64.
3. Домотенко Л. В., Шепелин А. П. Би­фидум-среда для выделения и культивирования бифидумбактерий // Инфекция и иммунитет. – 2014. – Т. 4. – № 3, С. 279–283.
4. Инактивация аммиака в курином помете бактериями-биодеструкторами / Г. Р. Садр­тдинова, Н. Н. Ка­рамышева, Д. Г. Сверкалова, А. Л. Игнатов, А. Г. Шестаков, Д. А. Васильев // Актуальные проблемы биологии, ­биотехнологии, экологии и биобезопасности. Меж­дународная научно-практическая конференция, посвященная 80-летию заслуженного ученого, профессора В. Л. Зайцева. – Гвардейский, 2015. – С. 254–257.
5. Современная микробиология: прокариоты : в 2 т. Т. 1 / пер. с англ. ; под ред. Й. Ленгелера, Г. Древса, Г. Шлегеля. – М. : Мир, 2005. –
   496 с.
6. Поиск перспективных штаммов лакто- и бифидобактерий для конструирования новых пробиотиков / Р. Х. Ти­мербаева, М. М. Туйгунов, Н. Р. На­зырова, Г. Б. Байрамгулова // Фундаментальные исследования. – 2005. – № 5. – С. 93–94.
7. Проявление антагонистических свойств бактерий Lactobacillus acidophilus в отношении бактерий Serratia marcescens и Klebsiella pneumonia / А. Г. Шес­таков, Н. И. Мо­лофеева, Л. П. Пуль­че­ровская, С. В. Мерчина, А. И. Кал­дыркаев, Д. А. Васильев // Актуа­льные вопросы ветеринарной науки : мат. Междунар. науч.-практ. конференции. – Ульяновск, 2015 г. –
   С. 114–116.
8. Asaka O., Shoda M. Biocontrol of Rhizoctonia solani damping-off of tomato with Bacillus subtilis RB14 // Appl. Environ. Microbiol. – 1996. – Vol. 62. – Pp. 4081–4085.
9. Backman P. A., Wilson M., Murphy J. F. Bacteria for biological control of plant diseases // In Environmentally safe approaches to crop disease control. – Lewis, Boca Raton. – 1997. – Pp. 95–109.
10. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology Second Edition William B.Whitman Bergey’s Manual Trust Department of Microbiology 527 Biological Sciences Building University of Georgia Athens, GA 30602-2605 USA 2009 г.
11. Brannen P. M., Kenney D. S. Kodiak – a successful biological-control product for suppression of soil-borne plant pathogents of cotton // J. Ind. Biotechnol. – 1997. – Vol. 19. – Pp. 169–171.
12. Chen T. W., Wu W. S. Biological control of carrot black rot // J. Phytopathol. – 1999. – Vol. 147. – Pp. 99–104.
13. Ljungh A. Lactobacillus. Molecular biology From Genomics to Probiotics / Edited by A. Ljungh, T. Wadstrom : Causter Academic Press, UK, 2009. – 205 р.
14. Maus J., Ingham S. Employment of stressful conditions during culture production to enhance subsequent cold- and acid-tolerance of bifidobacteria // J. Appl. Microbiol. – 2003. – Vol. 95. – Рp. 146–154.
15. Low-pH adaptation and the acid tolerance response of Bifidobacterium longum biotype longum // B. Sanchez, M.-C. Champomier-Vergès, Collado M. del C., P. Anglade, F. Baraige, Y. Sanz, de los Reyes-Gavilán C. G., A. Margolles, M. Zagorec // Appl. Environ. Microbiol. – 2007. – Vol. 73. – Рp. 6450–6459.
16. Sharma P. Limitation of congo-red staining techniques for the detection of cellulolytic activities: Biotech­nol // Lett., 1986/ – Vol. 8. –
    Pp. 579–580.
17. An immunostimulatory DNA sequence from a probiotic strain of Bifidobacterium longum inhibits IgE production in vitro / N. Takahashi, H. Kitazawa, T. Shimosato [et al.] // FEMS Immunol Med Microbiol. – 2006. – Vol. 46(3). – Рp. 461–469.
18. Talwalkal A., Kailasapathy K. The role of oxygen in the viability of probiotic bacteria with reference to L.acidophilus and Bifidobacterium spp. // Curr. Issues Intest. Micribiol. – 2004. – Vol. 5. – Рp. 1–8.

Метки: Общая биология

• Назад
• Вперед