ОСОБЕННОСТИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МЕЗЕНХИМНЫХ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ В ДВУХКАМЕРНОМ БИОРЕАКТОРЕ
Аннотация. Для культивирования клеточных культур с целью выращивания искусственного мяса, как альтернативного источника белка, необходимо наличие предназначенного для этого оборудования и детальное изучение параметров его успешной эксплуатации. Для получения на практике биомассы мезенхимных мультпотентных стволовых клеток животных ММСК КРС разработан двухкамерный биореактор, поддерживающий технологию культивирования в искусственной среде in vitro. Процесс получения мясного белка in vitro в культуральном устройстве осуществляется по разработанной технологии на основе технико-технологической схемы движения потоков жидкости и газа. Технология включает процессы заселения матрикса клеточными культурами в питательной среде в течение 1,5–2 часов, и дальнейшее выращивание клеточных культур: в питательной среде 7–10 суток, затем с индуктором в течение 4–6 суток и далее 30 суток и более в стандартной питательной среде. Основные контролируемые параметры глубинных процессов в двухкамерном культуральном устройстве следующие: температура культивирования 37,0 + 0,50С; поддержание рН буферно-нейтральной или слабощелочной среды на уровне 7,0–7,4 + 0,1; концентрации СО2 в воздушной смеси на уровне 5% + 0,1%, избыточное давление в биореакторе составляет 0,2 бара. Температура стерилизации устройства 122 °С + 1,0 °С. Перемена истощенной питательной жидкости осуществляется каждые 4 суток. Для фильтрации поступающего воздуха и потоков жидкости, во избежание контаминации, предусмотрено использование фильтров. Устройство предназначено для использования в исследовательских лабораториях, ветеринарии, медицине, животноводстве, а также в биотехнологической промышленности и т. д. Разработка научно обоснованных технических решений реакторных блоков и системы управления биореактора проведена на основе экспериментальных данных, полученных лабораторией стволовой клетки ФГБНУ ВИЭВ им. Я. Р. Коваленко.
Ключевые слова: стволовые клетки животных, альтернативный источник белка, искусственное мясо, технология in vitro, получение биомассы.
Процесс получения мясного белка в виде культурального мяса в искусственных условиях in vitro осуществляется на специализированном оборудовании на основе технико-технологической схемы, определяющей основные контролируемые параметры глубинных и сопутствующих процессов [1].
Методы исследований
Исследования проводились с использованием методов технико-технологического анализа, экспертных оценок, имитационного моделирования, теории исследования операций, конечных автоматов и автоматического регулирования.
Результаты исследований
Для выращивания стволовых клеток как альтернативного источника мясного белка по технологии in vitro было разработано культуральное устройство, представляющее собой двухкамерный биореактор. Биореактор состоит из четырех цилиндрических емкостей высотой 160 мм, и диаметром 100 и 130 мм. (рис.1), при этом предусмотрена возможность изменения объема емкостей за счет изменения высоты самих цилиндров (их смена).
Изготовленный культуральный двухкамерный биореактор имеет камеру перемешивания питательной жидкости и камеру роста биомассы стволовых клеток СК. Процесс перемешивания питательной жидкости в камере перемешивания биореактора осуществляется практически любым способом перемешивания, т. к. параметры перемешивания в данном случае могут не учитывать требований, связанных с наличием биообъектов в питательной среде [1, 2].
Обсуждение результатов исследований. На начальном этапе эксплуатации разработанного устройства готовится посев стволовых клеток на матрикс (заселение). Для процесса заселения клеточных культур подходит матрикс как 2D -, так и 3D- структуры, например, пористые скаффолды, шарики или бусины из слабо деградируемого пищевого биоматериала.
Скорость перемещения питательной жидкости из камеры перемешивания в смежную камеру роста предусмотрена такая, чтобы рабочий объем 0,7–1,0 л был заполнен в течение 60 мин, то есть 11,6 мл/мин. Частота подачи подготовленной питательной среды в камеру роста может изменяться с увеличением биомассы клеток.
Система подогрева представлена жидкостным термостатом ВТ-З с термоблоком потребляемой мощностью 2,2 кВт, электропитание термостата осуществляется от сети переменного тока напряжением 220 ± 22 В, частотой 50 ± 1 Гц.
При культивировании ММСК КРС в биореакторе в камере перемешивания применяются наиболее простые и дешевые условия подготовки питательной среды с образованием однородной концентрации компонентов, и достаточно хорошо отработанные способы режима автономного автоматизированного функционирования и теоретического расчета количества получаемой биомассы. Основным требованием остается то, чтобы по мере подачи подготовленной (посредством смешивания компонентов) питательной среды из камеры перемешивания в камеру роста, перемешивание обеспечивало поступление объема питательной среды, равного объему убывающей среды.
Условия, необходимые для роста биомассы, учитывающие требования, связанные с необходимостью заселения, адгезии, пролиферации дифференцировки и роста биообъектов в питательной среде, создаются в камере роста. Процесс перемешивания здесь отсутствует. Контроль рН в экспериментальном образце биореактора визуальный: норма рН среды – цвет томатно-красный, в случае закисления – желтый, защелачивания – фиолетовый.
Газовая смесь (атмосферного воздуха с 5% составом углекислого газа) поступает в камеру перемешивания при помощи двух компрессоров JAS1211. По технологии процесса углекислый газ поступает из углекислотного баллона с регулируемым вентилем и редуктором УР-6-6. Компоненты питательной среды по рецепту для перемешивания поступают через порт в верхней крышке. Верхние крышки обеих камер сделаны из нержавеющей стали, имеют 5 портов (рис. 2).
Нижние крышки обеих камер сделаны из нержавеющей стали, портов – 2 (рис. 3). Емкости соединяются между собой силиконовой трубкой через входные-выходные порты.
Образующиеся продукты метаболизма выводятся через порт в направлении «отходы».
Описание назначения портов в нижней крышке культурвльного биореактора для получения мяса in vitro как полноценного белка показано на рис. 3.
Реакторные блоки соединяются между собой и с системой термостатирования силиконовыми трубками через входные/выходные порты. Матриксы, обладающие заданной плотностью, с посеянными мезенхимными мультипотентными стволовыми клетками крупного рогатого скота (ММСК КРС) транспортируются в камеру роста через порт «загрузки биообъектов», так же данный порт снабжен пробоотборником (4, рис. 2). Наполнение культуральной средой и удаление истощенной среды происходит из камеры перемешивания происходит через соответствующий порт [4, рис. 3].
В целом, схема технологического процесса культивирования ММСК КРС состоит из 2-х основных схем: движения газов и жидкости, которые представлены на рис. 4.
Схема движения газов осуществляется через выход «воздух». Атмосферный воздух в систему поступает при помощи компрессора JAS1211. Углекислый газ (СО2) одновременно поступает в систему из регулируемого углекислотного газового баллона с редуктором УР-6-6 в количестве 5% к объему воздуха. Газы смешиваются, фильтруются и прогреваются до необходимой температуры с помощью термостатирующего устройства, затем потоки разделяются и поступают в камеру перемешивания и камеру роста.
Жидкие компоненты питательной среды поступают через порт «жидкие компоненты среды» в камеру перемешивания, где перемешиваются, насыщаются воздушной смесью, прогреваются до необходимой температуры и подаются в камеру роста периодически согласно принятой технологии культивирования.
Биообъекты подаются в систему и выводятся из нее в виде урожая через порт «Загрузка биообъекта/готовый продукт». Продукты метаболизма выводятся через порт «Отходы». В биореакторе культуральная среда занимает объем 70%, остальное – воздушная смесь с 5% СО2.
Технико-технологический процесс культивирования ММСК КРС состоит из 5 этапов. На 1-м этапе проходит подготовка культуральной среды из неоднородной смеси с оптимальным составом компонентов, поступивших в реакторный блок камеры смешивания. На 2-м этапе проводится залив в камеру роста подготовленной в камере смешивания культуральной среды.
Во время 3 этапа происходит основной рост и пролиферация клеток, в результате среда истощается и происходит выделение продуктов метаболизма клеток. На 4-м этапе начинается слив среды, слив осуществляется ламинарно, достаточно медленно для того, чтобы не ухудшить состояние клеток и не повредить их механически. На 5-м этапе после слива истощенной среды в камеру роста поступает новая порция. В этот момент начинается новый цикл.
Вывод
Разработка двухкамерного биореактора позволит обеспечить импортозамещение в нескольких секторах экономики – производстве биореакторов для биотехнологической сферы, в т.ч. для исследовательских целей в области ветеринарии и зоотехнии.
ЛИТЕРАТУРА
- Волкова И. М., Викторова Е. В., Савченкова И. П., Гулюкин М. И. Характеристика мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга и жировой ткани крупного рогатого скота / И. М. Волкова, Е. В. Викторова, И. П. Савченкова, М. И. Гулюкин // Сельскохозяйственная биология, 2012. № 2. 32–36.
- Сидорова В. Ю. Использование различных видов матриксов для культивации стволовых клеток крупного рогатого скота как альтернативного источника получения пищевого белка. Материалы международной научно-практической конференции «Сельское, лесное, рыбное хозяйство и АПК». Воронеж. 29 мая 2015 г. С. 13–22. ISSN 2308-1732.
- Post M. J. Cultured meat from stem cells: Challenges and prospects / M. J. Post //Meat Science. 2012. Vol. 92. P. 297–301.
Метки: Общая биология