ВЗАИМОСВЯЗЬ АКТИВНОСТИ АДЕНОЗИНДЕЗАМИНАЗЫ И СОДЕРЖАНИЯ ЛАКТАТА ПРИ ГИПОДИНАМИИ

Категория: Ветеринария и зоотехния.

Аннотация. Исследовалась активность ключевого фермента пуринового метаболизма – аденозиндезаминазы в сыворотке крови и тканях органов кроликов при гиподинамии. Гиподинамия провоцировалась горизонтальной фиксацией животных на спине. Исследование установило активацию катаболизма аденозина. Была выявлена взаимосвязь содержания субстрата аденозиндезаминазы аденозина и концентрации молочной кислоты в сыворотке крови животных, подвергнутых гиподинамии. При гиподинамии наблюдалось повышение содержания молочной кислоты – показателя кислородной задолженности клеток. Повышение концентрации молочной кислоты в опытной группе, вероятно, является результатом блокирования аэробных процессов гликолиза и активации анаэробного гликолиза. Подобный сдвиг гликолиза в сторону накопления молочной кислоты прерывает физиологически оправданный процесс энергообеспечения и нарушает энергетический обмен клетки, что свидетельствует о  негативном влиянии гиподинамии на организм. Активация катаболизма аденозина, а также увеличение содержания лактата, при гиподинамии, возможно, является результатом активации основных защитных систем организма. Для оценки возможностей воздействия на развивающиеся при стрессе физиологические изменения мы применили фитосбор (в качестве адаптогена). В качестве адаптогенного препарата использовался 5% водный экстракт фитосбора (Calendula officinalis L., Salvia officinalis L., Glycyrrhizae radix, Echinacea purpurea). Полученные результаты могут служить основанием для применения использованного нами фитосбора в качестве средства, предотвращающего неблагоприятные патологические эффекты при стрессогенных воздействиях. Метаболические сдвиги, сопровождающие гиподинамию было бы целесообразно учитывать в трактовке клинических биохимических анализов и проведения комплексной терапии пациентов, вынужденно подверженных ограничению двигательной активности.

Ключевые слова: гиподинамия, аденозиндезаминаза, лактат, фитосбор, сыворотка крови, анаэробный гликолиз

Двигательная активность является важным свойством животных и человека, это одно из условий их нормального существования и развития. Ограничение двигательной активности (гиподинамия) является одним из мощных стрессорных воздействий на организм и может вызывать развитие разнообразных патологических процессов [1, 2]. Исследование воздействия гиподинамии особенно актуально в связи с тем, что терапия многих заболеваний подразумевает определенную степень ограничения повседневной двигательной активности человека.

Показано, что состояние гиподинамии сопряжено с нарушением процессов поступления и утилизации кислорода в ткани и органы и может привести к клеточной гипоксии [3, 4]. Поскольку вследствие клеточной гипоксии меняется уровень энергообеспеченности процессов, начинает преобладать анаэробный гликолиз с накоплением лактата как конечного продукта, то повышение содержания лактата может сигнализировать о возникшем в результате стрессового воздействия кислородном дефиците. Так как выявлена зависимость между содержанием лактата и степенью развития различных патологий, в том числе стрессовых, некоторые авторы указывают на возможность применения колебаний содержания лактата в качестве маркера для индикации стрессового воздействия [5–8].

В настоящее время также представляет интерес изучение влияния лактата на течение патологических, стрессовых состояний через изменение активности некоторых ферментов, в частности ключевого фермента пуринового обмена аденозиндезаминазы (КФ 3.5.4.4) [10, 11]. Анализ экспериментального и клинического материала в области различных патологий и стрессовых состояний свидетельствует о немалом диагностическом значении определения аденозиндезаминазы (АДА) – фермента достаточно чувствительного к различным физиологическим изменениям организма [16]. Есть предположения, что при стрессе изменения активности АДА свидетельствуют об адекватной реакции организма на стрессовый фактор [12]. Аденозиндезаминаза необратимо дезаминирует аденозин и его различные аналоги, включая фармакологически активные, в инозин и его соответствующие малоактивные аналоги путем гидролитического замещения NH-групп на OH-группу в положении 6-го остатка пурина или другого гетероцикла [9]. Изучение активности аденозиндезаминазы представляет интерес в связи с тем, что его субстрат аденозин в зависимости от концентрации в 2–10 раз усиливает выход лактата по сравнению с контролем (без аденозина) [13]. А транспорт аденозина из клетки усиливается в условиях ацидоза, возможно обусловленного избытком лактата [14,15].

Исследование изменений активности АДА и содержания лактата является перспективным направлением для понимания степени нарушения функций организма в стрессовом состоянии, механизмов развития адаптационного синдрома, способствующим выявлению и возможности коррекции этих состояний.

Целью данной работы является изучение изменений концентрации лактата, активности АДА в динамике стрессорного воздействия (гиподинамии), а также в динамике стрессорного воздействия на фоне применения фитосбора.

Материалы и методы исследования

Лабораторные животные. Исследование проводили на кроликах самцах (домашний кролик, Oryctolagus cuniculus). Животные содержались в обычных условиях вивария, при стандартном режиме освещения и температуры (в помещении с температурой воздуха 22 °С, с 12-часовым циклом свет/темнота), имели свободный доступ к воде и пище.

Моделирование эксперимента. Нами был разработан временной период проведения эксперимента. Окончательный режим воспроизведения стрессорного воздействия был установлен на основании проведенных многочисленных вариаций (как с изменением продолжительности эксперимента, так и продолжительности стрессорного воздействия). Выяснилось, что длительность эксперимента 16 дней и ежедневная 3-х часовая гиподинамия позволяют получить достоверные и исчерпывающие данные по изучаемому вопросу. Формирование стресс-фактора вызывали путем горизонтальной фиксации животных на доске (16 дней, по 3 часа ежедневно). Влияние гиподинамии как классического стрессорного раздражителя на активность АДА, содержание лактата исследовали в сыворотке крови и тканях некоторых органов кроликов. Показатели определяли в первый и далее каждый 3 день моделирования стресса. Для исследований животные были разделены на 3 группы. Контролем служили интактные животные (I группа, n = 6), экспериментальной группой (группа II, n = 8) служили животные, подвергающиеся повторным воздействиям стресса, группой сравнения (группа III, n = 8) – животные, подвергающиеся гиподинамии с введением адаптогенa для оценки возможностей воздействия на физиологические изменения, развивающиеся при стрессе. В качестве адаптогенного препарата использовался 5% водный экстракт фитосбора (Calendula officinalis L., Salvia officinalis L., Glycyrrhizae radix, Echinacea purpurea). Экстракцию проводили при t = 70°C, в течение 20 мин. Экстракт применяли в дозировке 40 капель на 1 прием в день.

Определение биохимических показателей крови. Для исследований брали венозную кровь в силиконированную пробирку с гепарином каждый 3-ий день стрессорного воздействия. Активность АДА в сыворотке крови определяли по методике Гуисти и Галанти [17], основанной на колориметрическом определении аммиака с фенолгипохлоритом. Активность фермента выражали в мкмоль/мл. Молочную кислоту определяли по реакции Уффельмана [18].

Извлечение биологического материала. Для исследования последствий стресса на органы, сразу после последнего сеанса стрессорного воздействия животных выводили из опыта декапитацией. Ткани органов (мозг, печень) гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера–Эльведжейма в соотношении 1:10 (масса/объем) в K+ – фосфатном буфере (рН 7.4). Гомогенаты центрифугировали 10 мин при 1500 g. Активность АДА в гомогенатах тканей органов определяли методом Зелингсона в модификации Силаковой [19]. Активность фермента выражали в мкмоль/г.

Обработка результатов. Достоверность полученных различий оценивали с использованием t-критерия Стьюдента [20]. Статистически достоверными считали изменения при р < 0.05.

Результаты и обсуждение

Интенсивность метаболических изменений, происходящих при гиподинамии, оценивали по содержанию лактата и активности аденозиндезаминазы в сыворотке крови кроликов. В первый день стрессорного воздействия в сыворотке крови животных, подвергшихся гиподинамии (II группа), было выявлено снижение активности АДА относительно контрольной группы (I группа). Отмечалось различие показателей активности с исходными показателями на 26% (p < 0.05). Tенденция к снижению продолжалась и на 4 день стресса было зарегистрировано различие с контрольной группой на 35% (p < 0.05). Казалось по мере увеличения стрессорного воздействия активность фермента должна еще более отклоняться от уровня активности фермента интактных животных, однако далее наблюдалась динамика повышения активности фермента, и на 7-й день воздействия показатель АДА сыворотке крови достиг контрольных значений, а далее повышался (на 16 сутки относительно контрольной группы на 49%, p < 0.05) (рис. 1).

Для оценки возможностей воздействия на развивающиеся при стрессе физиологические изменения, был использован адаптогенный препарат (cм. Материалы и методы исследования). В первый день стресса активность АДА в сыворотке крови кроликов, подвергнутых стрессу с одновременным принятием экстракта (III группа), снизилась относительно контрольной группы на 23% (p < 0.05). Средние значения активности в группе с применением адаптогена соответствовали показателям в группе без коррекции. Однако активность АДА сыворотки крови животных, получавших адаптоген, через 7 дней после введения фитосбора превысила исходные показатели на 27.3% (p < 0.05), далее закономерность изменений активности фермента во II и в III группах сохранялась, но наблюдалось расхождение в уровне активности. К концу эксперимента показатели активности АДА во второй группе значительно превысили показатели III группы (рис. 2).

Поскольку гиподинамия затрагивает жизнедеятельность всего организма [21], целесообразно было рассмотреть ее влияние на биохимические процессы во внутренних органах. Надо отметить, что практически отсутствуют сведения о реакциях различных органов и тканей на стрессорные воздействия. Серия экспериментов по определению активности АДА в гомогенатах тканей печени, головного мозга кроликов на фоне гиподинамии указала на значительные изменения активности фермента в органах кролика (рис. 3). На 16-е сутки с момента стресса по сравнению с контрольной группой у животных II группы активность АДА ткани мозга снизилась на 37% (p < 0.05), а ткани печени – на 44.7% (p < 0.05) (рис. 3).

Существенные изменения активности АДА могут быть результатом относительного замедления катаболических процессов в тканях органов в условиях гиподинамии. У животных III группы значимых отклонений от исходных значений не было зарегистрировано и показатели находились в пределах физиологической нормы (активность АДА в го­могенатах тканей печени и мозга снижена на 1.4% и 1.03%, соответственно).

Параллельно исследованию ферментативной активности было рассмотрено влияние гиподинамии на концентрацию лактата в сыворотке крови лабораторных кроликов. Полученные данные свидетельствуют, что в первый день стрессового воздействия изменения концентрации лактата сыворотки крови в экспериментальных группах идентичны (рис. 4): как во II, так и в III группе животных концентрация лактата повысилась в 1,5 раза по сравнению с контрольными показателями (p < 0,05). Дальнейшая динамика повышения концентрации лактата в группе без применения фитосбора не соответствовала показателям группы, получавшей фитосбор. На 4-ыи день гиподинамии отмечалось расхождение в показателях (во II группе содержание лактата повысилось в 2,5 раза относительно интактной пробы, в III группе в 1,3 раза, p < 0,05). В группе без коррекции на 16-ые сутки выявлено увеличение концентрации лактата на 56,5% относительно физиологической нормы (p < 0,05), в группе с введением фитосбора на 11,1 % (p < 0,05).

Установлено, что при стрессах неизбежны дополнительные энергетические траты, которые являются так называемой «ценой адаптации» [22]. Одной из важнейших адаптивных реакций организма является мобилизация энергетических ресурсов, активация гликогенолиза, сопровождающееся накоплением продуктов расщепления глюкозы – лактата и пирувата. Увеличение содержания лактата в клетке при стрессе свидетельствует о недостаточном снабжения клеток кислородом, приводящем к клеточной гипоксии и увеличению доли анаэробного метаболизма глюкозы. Увеличение содержания лактата подтверждает, что стрессорное воздействие провоцирует нарушение гликолиза у животных, что снижает роль углеводов в энергетике организма.

С другой стороны накопление лактата может усилить выход аденозина из клеток и повышение активности АДА можно объяснить ацидозом. Но, возможно, изменения активности АДА есть результат изменения содержания аденозина, являющегося универсальным регулятором различных физиологических функций, в том числе, энергетического обмена [23].

Таким образом, можно констатировать, что при гиподинамии в сыворотке крови наблюдается активация катаболизма аденозина, а также увеличение содержания лактата, что, возможно, характеризует активацию основных защитных систем организма.

Заключение

1. При гиподинамии имеет место изменение активности аденозиндезаминазы, зависящее от степени (частоты) стрессорного воздействия.

2. Гиподинамия вызывает клеточную гипоксию, накапливается лактат, что нарушает энергетический обмен. Повышение содержания лактата в сыворотке крови при стрессовых воздействиях указывает на снижение интесивности аэробного гликолиза и активацию анаэробного.

3. Обнаруженные изменения активности АДА позволят создать комплекс профилактических мероприятий по предотвращению развития последствий влияния гиподинамии на организм.

4. Полученные результаты могут служить основанием для применения использованного нами фитосбора в качестве средства, предотвращающего неблагоприятные патологические эффекты при острых и хронических стрессогенных воздействиях.

Литература

1. Nayanatara A. K., Tripathi Y., Nagaraja H. S. et al Effect of chronic immobilization stress on some selected Physiological, biochemical and lipid parameters in Wistar Albino rats // Research J. of Pharmaceutical, Biol. and Chemical Sciences, 2012, No. 3. – Рp. 34–42.
2. Vaibhav W. Influence of stress and fluoxetine on immobility period of mice in tail suspension test and forced Swim test // Asian J. of Pharmaceutical and Clinical Research, 2016. – No. 9,
   Pp. 302–305.
3. Kaushal K.S., Kumar R. Stress, Oxidative Injury and Disease // Indian J. of Clinical Biochemistry, 2015, No. 30, Pp. 3–10.
4. Roef M.J., de Meer K., Kalhan S. C. et al Gluconeogenesis in humans with hyperlactatemia during low-intensity exercise // Am. J. Physiol, 2003, 284, Pp. 1162–1171.
5. Philp A., Macdonald A.L., Watt P.W. Lactate – a signal coordinating cell and systemic function // The J. Exp. Biol., 2005, 208, Pp. 4561–4575.
6. Mekitarian F.E, Horita S.M., Gilio A.E. et al. Cerebrospinal fluid lactate level as a diagnostic biomarker for bacterial meningitis in children // Int. J. Emerg. Med., 2014, 7, p. 14.
7. Proia P., Di Liegro C. M., Schiera G. et al Lactate as a metabolite and a regulator in the central nervous system // Int. J. Mol. Sci., 2016, No. 17(9), p. 1450.
8. Richard A.H., Tindale L., Lone A. et al Aerobic glycolysis in the frontal cortex correlates with memory performance in wild-type mice but not the APP/PS1 mouse model of cerebral amyloidosis // J. Neurosci., 2016. – No. 36 (6). – Рp. 1871–1878.
9. Bartzoka F., Venetsanou K., Clonis Y. Adenosine reagent-free detection by co-immobilization of adenosine deaminase and phenol red on an optical biostrip // Biotech. J., 2015. – No. 10(1). – Pp. 136–142.
10. Шатова О. П., Хомутов Е. В., Сташкевич М.А. и др. Участие лактата в парадоксе Хелстрома // Патология, 2011. – № 2, с. 3–5.
11. Anitha G., Mahaboob R., Obulesu G. Study of adenosine deaminase levels in the diagnosis of tuberculous pleural effusion // Intern. Arch. of Integrated Medicine, 2016. – No. 3(7). –
    Рp. 353–357.
12. Ильдербаев О.З., Шапекова Н.Л., Ильдербаева Г.О. и др. Оценка действия радиационного фактора в отдаленном периодe на активность ферментов метаболизма пуриновых нуклеотидов в различных органах и тканях в эксперименте // Мед. Науки, 2015, 12 (21), с. 69 – 72.
13. de Groot M.J., Coumans W.A., van der Vusse G.J. The nucleotide metabolism in lactate perfused hearts under ishaemic and reper fused conditions // Mol. Cell Biochem., 1992, 118, p. 1-14.
14. Алабовский В.В., Винокуров А.А., Хамбуров В.В. Некоторые механизмы защитного действия аденозина при кальциевом парадоксе // Рос. Физиол. Журн., 2004, 7, с. 889–901.
15. Sitkovsky M.V., Kjaergaard J., Lukashev D. et al Hypoxia-adenosinenrgic immunosuppression: tumor protection by T – regulatory cells and cancerous tissue hypoxia // Clin. Cancer Res., 2008, 14 (19), p. 5947 – 5952.
16. Mello P., Filippi-Chiela E., Nascimento J. et al Adenosine uptake is the major effector of extracellulare ATP toxicity in human cervical cancer cells // Molecular Biology of the Cell., 2014, 25 (19), p. 2905 – 2918.
17. Giusti, G., Galanti, B. Colorimetric method, Methods of enzymatic analysis // 3rd ed. Weinheim: Verlag chemie, 1984, 4, p. 315 – 323.
18. Кушманова О.Д. и др. Руководство к лаб. занятиям по биол. Химии // Медицина, 1983, с. 97-100.
19. Kanamori K., Parivar F., Ross B. ISN NMR study of in vivo cerebral glutamine synthesis in hyperammonic rats // Biomed, 1993, 6, p. 21.
20. Кобзарь А.И. Прикладная математическая статистика // Физматлит, 2006, с. 816.
21. Sangishetti V.P., Ghongane B.B., Nayak B.B. Effect of immobilization stress on organ indices, sperm quality, and testosterone level in rats: role of N-acetyl cysteine // J. of Chemical and Pharmaceutical Research, 2016, 8(5), Рp. 845–851.
22. Detka J, Kurek A., Kucharczyk M. et al Brain glucose metabolism in an animal model of depression // J. Neuroscience, 2015, 295, p. 198-208.
23. Randhawa P. K., Jaggi A.S. Unraveling the role of adenosine in remote ischemic preconditioning-induced cardioprotection // Life Sciences, 2016, 155, Рp. 140–146.

Метки: Ветеринария и зоотехния

• Назад
• Вперед