Разработка способа мультиплексной пцр для диагностики fiv- и felv-инфекции

Категория: Ветеринария и зоотехния.

Реферат. Установлено, что вирусный иммунодефицит и лейкемия кошек широко распространены в г. Саратове и в Саратовской области. По полученным данным из числа обследованных бродячих животных FIV-позитивными оказались 50% кошек, а FeLV-положительными – 43%, сочетанное инфицирование обоими вирусами было выявлено у 33% обследованных животных. Среди клинически здоровых животных 9% показывали наличие в крови провируса FIV, возбудитель FeLV у них обнаружен не был. Среди животных с клиническими проявлениями ­FIV-носительство было установлено у 60% кошек, у 37% животных констатировали наличие FeLV, в 23% случаев у кошек регистрировали одновременно FIV-FeLV микст-инфекцию. В результате компьютерного анализа полногеномных сиквенсов и сиквенсов фрагментов провирусной ДНК и вирусной РНК возбудителей лейкемии и иммунодефицита кошек было установлено, что степень гомологии вирусных геномов составляет около 50%, при этом имеются незначительные по длине участки полного совпадения и обнаруживается значительная вариа­бельность в структуре отдельно взятых генов. Наиболее консервативной областью у FeLV был определен фрагмент, располагающийся вначале гена gag-pol, а у FIV наиболее стабильной явилась область в терминальной части гена gag. Был осуществлен дизайн праймеров к консервативным участкам вирусных геномов, разработан состав смеси для проведения мультиплексной ПЦР, отработаны условия постановки реакции. На разработанный способ получен патент № 2586504, опубликованный 10.16.2016 (бюл. № 16). Способ является доступным по стоимости, достоверным, высокочувствительным и высокоспецифичным методом выявления фрагментов провирусной ДНК вирусов иммунодефицита и лейкемии кошек в лимфоцитах крови животных в короткие сроки. Разработанный способ показал регулярную воспроизводимость с клиническим материалом. При этом компьютерный анализ свидетельствовал об отсутствии реакции на гомологичные и гетерологичные организмы.

Ключевые слова: кошки, диагностика, лейкемия, вирусный иммунодефицит, мультиплексная полимеразная цепная реакция.

Вирусная лейкемия и вирусный иммунодефицит кошек являются медленно развивающимися неизлечимыми инфекциями, которые, как правило, приводят к летальному исходу. Возбудители этих заболеваний отнесены к семейству Retroviridae. Они характеризуются высоким уровнем генетической изменчивости и могут долгие годы не проявлять себя в зараженном организме. Вирусы лейкемии и иммунодефицита кошек (FIV и FeLV) вызывают трансформацию зараженных клеток и нарушение иммунитета. Иммунологические нарушения, вызываемые ретровирусами, приводят к вторичным инфекциям, развитию неоплостических процессов, а также к злокачественным процессам в нервной системе [5, 10].

Вирус иммунодефицита кошек поражает практически всех представителей семейства кошачьих, в том числе львов, пум, леопардов, снежного барса, тигров, ягуара, пантер, рысь и манула. Как сам вирус, так и антитела к нему обнаруживают не только у свободноживущих, но и у обитающих в зоопарках животных. Возбудитель вирусного иммунодефицита кошек тропичен к клеткам иммунной и нервной систем. Вирус поражает клетки, имеющие на своей мембране молекулу ­СD4-рецептора. Среди клеток иммунной системы этот рецептор имеют в основном Т-лимфоциты, выполняющие функции хелперных клеток. Внутри группы Feline lentivirus различают 6 генотипов: A, B, C, D, E и F. Кроме того, в природных популяциях выявлены несколько интер-подтипов FIV-рекомбинантов: A/B, A/C и B/D [7, 9].

Вирусной лейкемией страдают не только домашние, но и дикие кошки: камышовые коты, тигры, львы и т. п. Болеют животные в возрасте от 1 до 6 лет. Вирусная лейкемия кошек – опухолевое заболевание гемолимфопоэтической системы кошек, характеризующееся злокачественным разрастанием кроветворной ткани и нарушением процесса созревания кровяных клеток. FeLV можно разделить на несколько подгрупп, основываясь на антигенных различиях, детерминированных геномом: A, B, С, Т и D. Каждый тип вируса поражает определенный тип клеток, хотя иммунологически все подтипы тесно связаны [6, 8].

Большое разнообразие, а также высокая степень генетической вариа­бельности среди подтипов ретровирусов кошек осложняют создание эффективных средств специфической терапии и иммунопрофилактики данных инфекций и способствуют развитию эпизоотического процесса среди восприимчивых животных. В настоящее время своевременная диагностика ретровирусных инфекций животных является единственным средством контроля над их распространением [1, 2].

Существует ряд серологических тестов, определяющих структурные белки и гликопротеиды данных вирусов. Однако как отечественные, так и зарубежные исследователи сходятся во мнении, что выявление FIV и FeLV методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) значительно эффективнее, чем применение для диагностики этих инфекций серологических методов [3, 4, 10].

ПЦР для выявления провирусной ДНК – наиболее распространенный способ выявления как вирусоносителей, так и больных ретровирусными инфекциями кошек. Обусловлено это не только высокой чувствительностью и специфичностью метода, но и тем, что он учитывает важные особенности ретровирусов – способность к длительной персистенции без выраженного иммунного ответа и вероятность антигенной изменчивости.

ПЦР основана на многократном копировании (амплификации) специфического участка ДНК провирусного генома с последующей детекцией продуктов амплификации медом гельэлектрофореза или с помощью флуоресцирующих зондов. Специфичность реакции обусловливается праймерами – олигонуклеотидами, которые фланкируют уникальный участок ДНК провируса. Именно его и амплифицирует полимераза. В результате реакции из каждого фрагмента образуется более биллиона копий (ампликонов), которые впоследствии и визуализируются. Мультиплексная ПЦР – это модификация реакции, когда в одной системе используются две пары праймеров. В данном ­случае одна для выявления FIV, другая – FeLV.

Целью нашего исследования явилась разработка эффективного, быстрого и недорогого способа обнаружения ДНК провирусов иммунодефицита и лейкемии кошек методом мультиплексной ПЦР.

В соответствии с целью нами были определены следующие задачи:

• определить степень распространения ретровирусов в популяциях кошек с различным образом жизни;
• провести анализ структуры геномов FIV и FeLV с целью выявления наиболее консервативных участков;
• осуществить компьютерное моделирование праймеров и подбор оптимально сочетающихся между собой двух пар праймеров;
• оптимизировать условия постановки ПЦР с использованием подобранных пар праймеров in vitro;
• проверить эффективность работы подобранных праймеров с клиническим материалом.

  Материалом для исследования служили пробы периферической крови, полученной от бродячих кошек, от домашних кошек, поступивших в УНТЦ Ветеринарный госпиталь СГАУ с неясными симптомами и от домашних клинически-здоровых животных. В общей сложности было исследовано 388 образцов.

  Выделение и очистку нуклеиновых кислот из крови кошек осуществляли методом нукле­о­сорбции на силикогеле с использованием набора ­«ДНК-сорб-В» (ООО «ИнтерЛабСервис», Россия). Предварительное определение провирусов FIV и FeLV осуществляли с использованием наборов «ВИК» и «Лейкис» производства «ИнтерЛабСервис» (Россия) на приборе Rotor-Gene™ 6000 (Австрия). Исследование разработанным способом проводили на приборе «Т100» BioRad (США). Учет осуществляли методом гельэлектрофореза в 1,5%-ном агарозном геле с добавлением бромистого этидия в качестве интерколирую­щего красителя для ДНК. Результат учитывали на оборудовании фирмы BioRad (США). Для определения размера ампликонов использовали маркер молекулярных масс “1 kb DNA ladder” (Stratagene, США).

  Анализ полногеномных сиквенсов и сиквенсов фрагментов провирусной ДНК и вирусной РНК возбудителей лейкемии и иммунодефицита кошек, размещенные на ресурсе NCBI, осуществляли методом компьютерного моделирования с применением компьютерных программ: «Нуклеотидные последовательности и характеристики геномов, вариабельных тандемных повторов, олигонуклео­тидных праймеров и зондов штаммов возбудителей бактериальных и вирусных инфекций I–II групп патогенности» (свидетельство о госрегистрации базы данных № 2011620585 (авторы – Ю. И. Яшечкин, Е. В. Найденова, С. А. Щербакова)) и «Программа расчета олигонуклеотидных праймеров на гомологичных геномах ­РНК-содержащих вирусов для их выявления в ПЦР и формирования базы данных» (свидетельство о госрегистрации программ для ЭВМ № 2013613699 (авторы – Ю. И. Яшечкин, Е. В. Най­денова, С. А. Щербакова)). Вырав­нивание геномных последовательностей осу­ществлялось методом Clusta W, кластерное дерево моделировали методом невзвешенного попарного среднего – UPGMA.

  Для подбора оптимально сочетающихся между собой двух пар праймеров использовали компьютерную программу GeneRunner. Проверку качества и термодинамический анализ выбранных праймеров выполняли с помощью программ OLIGO DNA/RNA primer analysis software v. 5.0. и BLAST.

  Оптимизацию условий проведения ПЦР осуществляли на амплифицаторах «АМПЛИ 4» («Биоком», Россия) и «Т100» (BioRad, США).

  В результате исследования проб крови было установлено, что степень инфицирования кошек ретровирусами довольно высокая, особенно бродячих животных (рис. 1).

  По полученным данным из числа обследованных бродячих животных FIV-позитивными оказались до 50% кошек, а FeLV-положительными – 43%. При этом сочетанное инфицирование обоими вирусами было выявлено у 33% обследованных животных. Среди обследованных нами клинически здоровых животных лишь 9% показывали наличие в крови провируса иммунодефицита кошек. Возбудитель FeLV у них обнаружен не был. Тогда как среди животных со стоматологическими проблемами (гингивиты, пародонтиты, стоматиты) и другими воспалительными поражениями слизистых оболочек и кожи (конъюнктивиты, пиодермии, отиты и др.) FIV-носительство было установлено у 60% кошек. У 37% животных констатировали наличие FeLV. При этом в 23% случаев у кошек регистрировали одновременно FIV и FeLV, то есть микст-инфекцию.

  На рисунках 2 и 3 представлены схемы строения геномов вирусов иммунодефицита и лейкемии кошек, где показано, что вирусы содержат аналогичные гены и имеют примерно одинаковый размер геномов.

  Как следует из рисунков 2 и 3, несмотря на схожесть строения вирусных геномов, продукты экспрессии FIV и FeLV различны, что объясняется различиями в патогенезе вызываемых ими заболеваний.

  Последующий компьютерный анализ и сравнение геномов ретровирусов кошек показали высокую степень вариабельности их нуклеотидного профиля (рис. 4–6).

  Рисунок 4 иллюстрирует степень гомологии геномов FIV и FeLV. Она составляет около 50%, при этом имеются незначительные по длине участки полного совпадения. Кластерное дерево показывает достаточно отдаленную филогенетическую связь вирусных геномов.

  На рисунке 5 представлено кластерное дерево и анализ гомологии полногеномных сиквенсов FIV, показывающие, что уровень генетической вариабельности между «дикими» и «городскими» штаммами FIV достаточно выраженный. Внутри каждой группы различают по 5–6 субтипов, и наибольшая вариабельность обнаруживается у вирусов диких представителей семейства кошачьих.

  Для дальнейшего анализа были взяты гены gag-pol FeLV и gag FIV, так как по литературным данным наименее консервативным у ретровирусов является ген inv, на основании вариабельности которого и происходят разделения на типы и субтипы внутри вида (рис. 6, 7).

  На рисунках 6 и 7 показана вариабельность генов gag-pol FeLV (рис. 6) и gag FIV (рис. 7), где видны как участки с высокой степенью гомологии, так и отрезки с крупными и незначительными делециями. Анализ вирусных геномов показал достаточно высокую степень гомологии FIV и FeLV. При этом обнаруживалась значительная вариабельность в структуре отдельно взятых генов. Наиболее консервативной областью у FeLV был определен фрагмент, располагающийся в начале гена gag-pol, а у FIV наиболее стабильной явилась область в терминальной части гена gag.

  С помощью компьютерной программы GeneRunner геном вирусов в формате FASTA применяли для подбора праймеров на участке гена gag FIV и на участке, расположенном непосредственно перед геном gag-pro-pol FeLV, как наиболее консервативных областях геномов данных вирусов, как показали наши исследования.

  При дизайне праймеров основными требованиями были: степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков внутри праймеров и комплементарности друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); близость значений температуры отжига и плавления праймеров.

  На основании проведенного компьютерного анализа были подобраны несколько пар олигонуклеотидных праймеров, имеющих оптимальные размер и структуру. ПЦР проводили в объеме реакционной смеси – 25 мкл на 1 пробу. Состав реакционной смеси подбирали таким образом, чтобы концентрация ионов MgCl2 (1–1,5 мМ) обеспечивала оптимальную скорость и точность работы фермента Taq-полимеразы, концентрация дНТФ – 0,4 мМ, концентрация праймеров – 10–15 пмоль/мкл и объем пробы – 5 мкл, что способствует повышению специфичности реакции. При использовании амплификатора с крышкой без нагрева на смесь наслаивали 20 мкл минерального масла для ПЦР. При использовании амплификатора с нагревающейся крышкой минеральное масло не использовали.

  Для проверки эффективности работы подобранных праймеров с клиническим материалом (кровь) в качестве положительного контроля использовали ДНК, выделенную из крови бродячих кошек, у которых наличие FIV и FeLV были подтверждены методом иммунной хроматографии и Real-time PCR. По результатам эксперимента in vitro были отобраны две пары праймеров: PrmFFIV – AAGAGTCCCAAATATGCCATA GG, PrmRFIV – TCCATCCAAATTG CTACTGTTC и PrmFFeLV – GA ATAAACCTCTTGCTGTTTGC, PrmRFeLV – AATCAGATCGAATGA CAGAGA CAC. В результате работы одной пары (PrmFFIV и PrmRFIV) образуется фрагмент длиной 397 п. н., в результате работы другой пары (PrmFFeLV и PrmRFeLV) – длиной 221 п. н.

  Температурно-временной режим проведения реакции представлен в таблице 1.

  Таблица 1 – Температурно-временной режим проведения ПЦР

  Этап	Т, °С	Время, с		Количество ­повторов
  		Для амплификатора с ­матричным ­регулированием ­температуры	Для ­амплификатор с активным ­регулированием ­температуры
  Начальная ­денатурация	95	180	180	1
  Денатурация	95	60	20	35 циклов
  Отжиг	56	60	20
  Элонгация	72	60	40
  Заключительная элонгация	72	300	300	1
  Хранение	4	–	600	1

  На рисунках 8 и 9 представлены результаты ПЦР с разработанными праймерами методом гельэлектро­фореза.

  Как показано на рисунке 8, при постановке ПЦР с заведомо положительными пробами в электрофоретических дорожках проб 1, 4, 5, 7 и 8 присутствуют полосы на уровнях 397 и 221 п. н., что свидетельствует о наличии в пробах ДНК провирусов FIV и FeLV. В электрофоретических дорожках проб 2, 3 и 6 присутствуют полосы только на уровне 221 п. н., что свидетельствует о присутствии в пробах только ДНК провируса FeLV.

  Как показано на рисунке 9, при исследовании крови подозрительных в заражении FIV и FeLV кошек пробы 1, 2, 3, 4, 5, 9 содержат ДНК прови­русов FIV и FeLV, электрофоретическая подвижность ампликонов которых 397 и 221 п. н. соответственно, что совпадает с размерами ампликонов положительного контроля (К+). Пробы 6, 7, 10 содержат только ДНК провируса FeLV, электрофоретическая подвижность ампликонов которого 221 п. н., проба 8 – отрицательная. В электрофоретической дорожке, соответствующей отрицательному контролю (К–), полосы отсутствуют.

  На разработанный способ получен патент № 2586504 (опубликован 10.16.2016, бюл. № 16). Способ является доступным по стоимости, достоверным, высокочувствительным и высокоспецифичным методом выявления фрагментов провирусной ДНК вирусов иммунодефицита и лейкемии кошек в лимфоцитах крови животных в короткие сроки. Разработанный способ показал регулярную воспроизводимость с клиническим материалом. При этом компьютерный анализ свидетельствовал об отсутствии реакции на гомологичные и гетерологичные организмы.

  ЛИТЕРАТУРА

  1. Золототрубнов А. П. Эпизоотология и профилактика ретровирусных инфекций кошек // Ветеринарный консультант. – 2006. – № 17. – С. 25–26.
  2. Красникова Е. С., Агольцов В. А., Ларионова О. С., Красников А. В. Новый подход к разработке противоэпизоотических мероприятий при BLV инфекции и его научное обоснование // Научная жизнь. – 2015. – № 6. – С. 156–163.
  3. Красникова Е. С., Красников А. В., Агольцов В. А. Оценка диагностической ценности полимеразной цепной реакции и иммунохроматографического анализа при некоторых превалирующих ретровирусных инфекциях кошек // Аграрный научный журнал. – 2013. – № 2. – С. 21–23.
  4. Марушева Ю. А., Красникова Е. С. Совершенствование диагностики вирусного иммунодефицита кошек // Вестник Ветеринарии. – 2014. – № 3(70). – С. 29–33.
  5. Супотницкий М. В. Эволюционная патология. К вопросу о месте ­ВИЧ-инфекции и ВИЧ/СПИД-пан­демии среди других инфекционных, эпидемических и пандемических процессов. – М., 2009. – 400 с.
  6. Infectious endogenous retroviruses in cats and emergence of recombinant viruses / Y. Anai, H. Ochi, S. Watanabe, S. Nakagawa [et al.] // Journal Virol. – 2012. – Vol. 86(16). – Pp. 8634–8644.
  7. Three pathogens in sympatric populations of pumas, bbcats, and domestic cats: implications for infectious disease transmission / S. N. Bevins, S. Carver, E. E. Boydston, L. M. Lyren, M. Alldredge, K. A. Logan, S. P. Riley, R. N. Fisher, T. W. Vickers, W. Boyce, M. Salman, M. R. Lappin, K. R. Crooks, S. VandeWoude // PLoS One. – 2012. – Vol. 7, v. 7(2).
  8. Feline leukemia virus outbreak in the critically endangered Iberian lynx (Lynx pardinus): high-throughput sequencing of envelope variable region A and experimental transmission / C. P. Geret, V. Cattori, M. L. Meli, B. Riond, F. Martínez, G. López, A. Vargas, M. A. Simón, J. V. López-Bao, R. Hofmann-Lehmann, H. Lutz // Arch Virol. – 2011. – No. 156(5). – Pp. 839–854.
  9. Hayward J. J., Rodrigo A. G. Recombination in feline immu­nodeficiency virus from feral and companion domestic cats // Journal Virol. – 2008. – No. 5. – P. 76.
  10. Hartmann K. Clinical Aspects of Feline Retroviruses: A Review // Viruses. – 2012. – No. 4(11). – Pp. 2684–2710.

Метки: Ветеринария и зоотехния

• Назад
• Вперед