ВЛИЯНИЕ БИОСПОРИНА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ МАКРОФАГОВ ПЕРИТОНЕАЛЬНОГО ЭКССУДАТА БЕЛЫХ МЫШЕЙ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВИДАХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ХРОНИЧЕСКОГО СТРЕССА

Категория: Ветеринария и зоотехния.

Реферат. Настоящая работа посвящена изучению влияния Биоспорина на функциональную активность макрофагов перитонеального экссудата белых мышей при различных видах экспериментального хронического стресса. В экспериментальных исследованиях использовали разные модели хронического стресса, гарантирующие развитие стрессовой реакции. Иммобилизационный стресс был направлен на непривычное ограничение в движениях животного. Классический метод Порсолта представлял собой комбинированный жесткий вид стресса, сочетающий физический и эмоциональный компоненты. Использование мигающего светового раздражителя позволило целенаправленно влиять на изменение суточного ритма животных. Указанные виды стрессоров позволили смоделировать наиболее часто встречающиеся в животноводстве стрессы у сельскохозяйственных животных, такие как: гипокинезический стресс, который возникает при длительном стойловом безвыгульном содержании животных, световой стресс, обусловленный недостаточным естественным освещением помещений для содержания животных, а также стресс, возникающий в результате сильного переутомлением животных при их чрезмерной эксплуатации. Установлено, что различные виды экспериментального хронического стресса оказывают влияние на функциональную активность макрофагов перитонеального экссудата белых мышей, которая сопровождается угнетением поглотительной способности и дефектом адгезивных свойств фагоцитов. Наиболее вероятной причиной, объясняющей депрессию поглотительных и адгезивных свойств макрофагов, можно назвать избыточную продукцию гормонов коры надпочечников, которые приводят к снижению функциональной активности лейкоцитов продуцирующих цитокины. Цитокинам принадлежит важная роль в регуляции функциональной активности макрофагов. Предварительное введение Биоспорина оказывает иммуностимулирующее влияние на функциональную активность макрофагов, что может быть обусловлено всасыванием в кишечнике компонентов клеточных стенок и продуктов метаболизма микроорганизмов входящих в состав пробиотика.

Ключевые слова: хронический экспериментальный стресс, перитонеальные макрофаги, адгезия и распластывание макрофагов, поглотительная способность макрофагов, лабораторные животные.

Проблема низкой адаптационной способности у сельскохозяйственных животных к воздействию стрессоров обусловлена современными методами ведения промышленного животноводства, а также ухудшением экологических факторов окружающей среды. В связи с этим изменяется комплекс приспособленческих механизмов, в процессе реализации которых происходит либо адаптация к стрессору, либо полная утрата резистентности, завершающаяся гибелью животных.

В период адаптации к острым или хроническим воздействиям неблагоприятных факторов нарушается гармоничность функционирования всех систем организма животных, и в первую очередь, угнетается деятельность иммунной системы.

Необходимо отметить, что в последние годы исследователи рассматривают функционирование иммунной системы при стресс-реакции в совокупности с работой кишечника, принимающего активное участие в реализации иммунных механизмов. Кишечная микрофлора обеспечивает формирование ключевых сигналов для созревания иммунной системы и активно контролирует связанный с кишечником иммунный гомеостаз [1].

С другой стороны, иммунодефицитное состояние макроорганизма, вызванное стрессом, является предпосылкой для изменения кишечного микробиоценоза, что обусловлено утратой способности у нормальной микрофлоры прикрепляться к рецепторам эпителиальных клеток слизистой оболочки и проявляется резким выведением бактерий-пробионтов из кишечника [2].

Предупреждение или минимизация отрицательных последствий стрессов является одним из важнейших факторов сохранения здоровья, повышения продуктивности животных и снижения затрат на получение продукции.

Одним из способов решения проблемы стрессовых состояний у сельскохозяйственных животных является применение лекарственных препаратов, способных предотвратить отрицательные последствия воздействия неблагоприятных факторов. Однако имеющиеся на сегодняшний день фармакологические средства не способны в полной мере решить вопросы адаптации стрессовых состояний у сельскохозяйственных жи­вотных.

Перспективным направлением решения проблемы дезадаптации сельскохозяйственных животных является использование пробиотических препаратов, сочетающих в себе такие важнейшие характеристики как эффективность и безопасность применения.

Исследованиями ряда авторов [3, 4] показано, что некоторые микроорганизмы, входящие в состав пробиотических препаратов способны не только оптимизировать микрофлору кишечника, но и стимулировать иммунную систему при воздействии на организм стрессовых факторов.

С этих позиций особый интерес представляет препарат Биоспорин, созданный на основе двух штаммов спорообразующих бактерий – В. subtilis 3 и B.licheniformis 31. Биоспорин широко применяется для коррекции нарушений микрофлоры кишечника, вызванных не рациональным применением антибиотиков, нарушением питания, перенесенными инфекционными заболеваниями, для профилактики и лечения острых кишечных инфекций.

Кроме того установлено, что Биоспорин обладает выраженным иммуномодулирующим действием на макроорганизм за счет индукции синтеза эндогенного интерферона, стимуляции активности лейкоцитов крови, синтеза иммуноглобулинов [5].

Экспериментальные исследования и опыт применения Биоспорина в ветеринарной практике свидетельствуют о его высокой эффективности при профилактике и лечении патологических состояний у сельскохозяйственных животных [6–8].

Несмотря на достаточно длительное изучение и использование пробиотика Биоспорина в медицинской и ветеринарной практике, его потенциальные возможности раскрыты далеко не полностью. В частности, вопросы влияния Биоспорина на изменение реакций иммунной системы макроорганизма, а именно, на клеточные факторы неспецифической защиты макроорганизма, при стрессе сельскохозяйственных животных остаются недостаточно изученными.

Исходя из вышеизложенного, целью данного исследования являлось изучение влияния Биоспорина на функциональную активность макрофагов перитонеального экссудата белых мышей при различных видах экспериментального хронического стресса.

Объектом исследования настоящей работы являлись лабораторные животные – беспородные инбредные белые мыши, половозрелые самцы массой 20–26 г. Животные содержались в соответствии со стандартом (GLP) – надлежащей лабораторной практики [9, 10]. Мониторинг здоровья животных осуществляли согласно «Положению о государственном ветеринарном надзоре в РФ» от 16.04. 2001 № 295 [11].

В работе использовали ампульную форму Биоспорина, доза которого соответствовала одной разовой дозе для человека и в перерасчете на массу лабораторной мыши составляла 1∙106 клеток на одно животное в объеме 0,5 см3 дистиллированной воды.

В настоящей работе в качестве модели хронических стрессовых воздействий применяли иммобилизационный стресс (ИС) – ограничение движения, вынужденное плавание – тест Порсолта (ТП), а также стресс, создаваемый с помощью мигающей лампы – мигающий световой раздражитель (МСР).

Иммобилизационный стресс создавали методом жесткой фиксации конечностей животного к стальной решетке в положении на спине по 19 ч в течение 10 суток [12].

Тест Порсолта или метод вынужденного плавания представляет собой комбинированный жесткий вид стресса, сочетающий в себе физический и эмоциональный компоненты. Животные каждой опытной группы плавали по одному разу в сутки по 3–3,5 ч, в течение 5 суток [13].

При стрессировании мигающим светом нами была использована модель хронического сбоя суточного биоритма животных. Стресс создавали путем постоянного яркого мерцания лампы накаливания мощностью 220 Вт в затемненном боксе по типу «светло – темно» в течение 21 суток. Интервал между вспышками составлял 3,0 сек, а длительность светового сигнала – 1,5 секунд [14, 15].

Указанные виды стрессоров позволили смоделировать наиболее часто встречающиеся в животноводстве стрессы у сельскохозяйственных животных, такие как: гипокинезический стресс, который возникает при длительном стойловом безвыгульном содержании животных, световой стресс, обусловленный недостаточным естественным освещением помещений для содержания животных, а также стресс, возникающий в результате сильного переутомлением животных при их чрезмерной эксплуатации.

При моделировании разных видов экспериментального хронического стресса были сформированы группы белых мышей и использованы различные схемы применения Биоспорина, представленные в таблице 1.

В таблице представлена схема опыта по применению Биоспорина при разных видах экспериментального хронического стресса.

Таблица 1 – Схема опыта

Примечания:1. БС – Биоспорин. 2. ИС – иммобилизационный стресс. 3. ТП – тест Порсолта. 4. МСР – мигающий световой раздражитель. 5. «–» исследования не проводились.

Как следует из схемы опыта, представленной в таблице, для каждой модели стресса было сформировано по четыре группы лабораторных мышей:

– первую группу составили животные подверженные стрессу на фоне предварительного введения Биоспорина;

– во вторую группу вошли мыши, к которым применяли стрессовое воздействие без предварительного введения Биоспорина;

– животным третьей группы вводили Биоспорин без последующего стрессирования;

– четвертую контрольную группу составили интактные белые мыши.

Продолжительность иммобилизационного стресса составила 10 сут, теста Порсолта – 5 сут, а мигающего светового раздражителя – 21 сутки. При всех видах экспериментального хронического стресса Биоспорин вводили ежедневно однократно перорально. Курс введения пробиотика составил: при иммобилизационном стрессе – 7 сут, в тесте Порсолта – 8 сут, при воздействии мигающего светового раздражителя – 10 суток. По истечении всех видов стрессирования животных умерщвляли методом цервикальной дислокации. Перитонеальные макрофаги забирали по общепринятой методике [16].

Функциональную активность фагоцитов оценивали по их поглотительной способности на модели поглощения частиц латекса, а также по степени адгезии распластывания.

Адгезивные свойства макрофагов оценивали по методу, основанному на способности клеток прикрепляться к пластиковой поверхности. С этой целью клеточную суспензию в объеме 2 см3 в концентрации 1 × 106 в 1 см3 помещали в пластиковые чашки Петри и инкубировали при 37 °С в течение 60 и 90 минут. По истечении этого времени слой прилипших клеток дважды промывали готовой 199 средой с целью удаления не прилипших клеток, после чего препарат помещали в раствор метанола для фиксации. С помощью световой микроскопии определяли показатель адгезии, т. е. суммарное число макрофагов, прикрепившихся к стеклу на стандартной площади (10 произвольных полей зрения).

Оценку распластывания макрофагов также проводили при световой микроскопии по методу Rollany H. (1982) [17]. При этом, не распластанными клетками считались клеточные элементы округлой формы без отростков, а за распластанные макрофаги принимали клетки неправильной формы с отростками, у которых расстояние между ядром и наружной границей клетки превышало радиус ядра. Результаты теста распластывания макрофагов оценивали путем определения процентного отношения распластанных форм к общему числу прикрепившихся клеток [18].

На первом этапе экспериментальных исследований оценивали влияние пробиотического препарата Биоспорин на фагоцитарную активность макрофагов перитонеального экссудата белых мышей после иммобилизационного стресса. Результаты поглотительной способности фагоцитов представлены на рисунке 1.

На основании полученных результатов было установлено, что системное ограничение движения лабораторных мышей приводит к угнетению факторов неспецифической резистентности в организме животных, что проявляется снижением поглотительной способности перитонеальных макрофагов.

Так, фагоцитарный показатель (ФП) макрофагов, демонстрирующий процент активных фагоцитов, и фагоцитарное число (ФЧ), свидетельствующее об интенсивности фагоцитоза, во второй опытной группе ниже аналогичных значений у мышей контрольной группы на 50 и 38,7% соответственно.

Предварительное введение Биоспорина в условиях иммобилизации белых мышей способствует увеличению активности макрофагов перитонеального экссудата животных. Наблюдается активация фагоцитов по отношению к тест-объекту, что сопровождается увеличением значений поглотительной способности макрофагов. ФП и ФЧ у животных первой опытной группы выше аналогичных значений у животных второй опытной группы на 33,6 и 20,6 % соответственно, что свидетельствует об иммуностимулирующем влиянии пробиотика на поглотительную способность фагоцитов.

На следующем этапе исследования оценивали влияние Биосприна на фагоцитарную активность макрофагов белых мышей в тесте Порсолта.Результаты поглотительной способности макрофагов перитонеального экссудата белых мышей по окончании стрессирования в тесте Порсолта представлены на рисунке 2.

В результате проведенных исследований было установлено, что максимальная мышечная нагрузка угнетает поглотительную способность макрофагов перитонеального экссудата у лабораторных мышей второй группы. Значения ФП снижено более чем в четыре раза по сравнению с аналогичным показателем у интактных животных контрольной группы, а фагоцитарное число почти в два раза ниже аналогичного показателя у интактных мышей контрольной группы.

Важно отметить влияние Био­спорина на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов при указанном виде стресса. ФП и ФЧ фагоцитов перитонеального экссудата белых мышей первой опытной группы выше аналогичных значений у животных второй группы более чем в два раза.

Следующим этапом наших исследований явилось исследование влияния Биоспорина на фагоцитарную активность фагоцитов белых мышей при мигающем световом раздражителе, результаты которых приведены на рисунке 3.

Анализ результатов исследований показывает, что мигающий световой раздражитель, применяемый к лабораторным мышам в течение продолжительного времени, также оказывает влияние на неспецифические факторы иммунитета животных, о чем свидетельствуют показатели поглотительной способности макрофагов брюшной полости. ФП и ФЧ у мышей опытной второй группы ниже аналогичных показателей интактных животных на 40,5 и 32,4 % соответственно. Предварительное введение Биоспорина приводит к увеличению показателей фагоцитоза. Так ФП и ФЧ у мышей первой опытной группы выше аналогичных значений у животных второй опытной группы на 12,0 и 6,3 % соответственно.

Для углубленного изучения функциональной активности макрофагов нами были изучены свойства адгезии и распластывания, отражающие прежде всего, состояние рецепторного аппарата клеточной мембраны, что имеет большое значение в межклеточных взаимодействиях с лимфоцитами, клетками эндотелия и другими клетками и субстратами микроокружения в организме.

Влияние Биоспорина на способность перитонеальных макрофагов к адгезии и распластыванию у лабораторных животных при различных видах экспериментального, хронического стресса приведены в таблице 2.

На основании полученных результатов нами было установлено, что у белых мышей при всех видах экспериментального хронического стресса выявлено более низкое количество макрофагов способных к спонтанной адгезии. Так, число адгезированных клеток через 60 и 90 минут от начала инкубации при иммобилизационном стрессе у мышей второй опытной группы ниже аналогичных значений у интактных животных (четвертая группа) на 64,0 и 61,2 %, в тесте Порсолта на 70,2 и 67,5 %, а при мигающем световом раздражителе на 31,5 и 29 % соответственно.

Аналогичным образом стресс влияет и на изменение количества распластанных макрофагов. Так, при иммобилизационном стрессе количество распластанных фагоцитов через 60 и 90 минут от начала инкубации во второй группе мышей ниже аналогичных показателей у интактных животных на 53,6 и 55,3 %, в тесте Порсолта на 64,3 и 58,7 %, при мигающем световом раздражителе на 43,0 и 58,1 % соответственно.

Наиболее вероятной причиной, объясняющей депрессию адгезивных свойств макрофагов, можно назвать избыточную продукцию гормонов коры надпочечников, которые приводят к снижению функциональной активности лейкоцитов продуцирующих цитокины. Цитокинам принадлежит важная роль в регуляции функциональной активности макрофагов. Цитокины контролируют процессы пролиферации и дифференцировки макрофагов в костном мозге, а также обладают свойством быстро и эффективно стимулировать функциональную активность клеток.

Предварительное введение Биоспорина приводит к повышению свойств адгезии и распластывания макрофагов, что сопровождается увеличением количества адгезированных и распластанных клеток.

Число адгезированных фагоцитов через 60 и 90 минут от начала инкубации при иммобилизационном стрессе у мышей первой опытной группы выше аналогичных значений у животных второй группы на 26,7 и 24,8 %, в тесте Порсолта на 20,5 и 15,4 %, при мигающем световом раздражителе на 12,7 и 13,6 %. Полученные результаты коррелируют с результатами, демонстрирующими способность макрофагов к распластыванию.

В результате проведенных исследований установлено, экспериментальный хронический стресс приводит к депрессии поглотительной способности и дефекту функций адгезии и распластывания макрофагов перитонеального экссудата белых мышей. Предварительное введение Биоспорина при моделировании разных видов экспериментального хронического стресса приводит к повышению функциональной активности макрофагов перитонеального экссудата белых мышей, сопровождающееся увеличением показателей поглотительной способности и адгезирующей функции фагоцитов.

Таким образом, данными исследований показано, что предварительное введение Биоспорина в условиях хронического экспериментального стресса оказывает иммуностимулирующее влияние на функциональную активность макрофагов перитонеального экссудата белых мышей.

ЛИТЕРАТУРА

1. Хромова С. С. Имммунорегуляция в системе микрофлора интестинальный тракт [Текст] / С. С. Хромова, Б. А. Ефимов, Н. П. Тарабрина // Аплергол. и иммунол. – 2004. – Т. 5. – № 2. – С. 265-271.
2. Лазарева Т. С. Желудочно-ки­шечный тракт, микрофлора и иммунитет [Текст] Т. С. Лазарева, Ф. Ф. Жвания // Питание и иммунитет. – 2009. – С. 46–50.
3. Учасов Д. С. Эффективность применения пробиотика Проваген при технологическом стрессе у свиней [Текст] / Д. С. Учасов, Н. И. Ярован, О. Б. Сеин // Вестник Орел ГАУ. – 2013. – № 1. – Т. 40. – С. 129.
4. Данилевская А. Н. Целесообраз­ность назначения пробиотиков при стрессе, связанном с процессом отлова и транспортировки овцебыков в условиях республики Саха-Якутия [Текст] / А. Н. Данилевская, В. Р. Груздев, Т. П. Сипко // Международная научная конференция: Москва, 2004. – С. 24.
5. Хорошилова Н. В. Терапевтическая эффективность пробиотиков [Текст] / Н. В. Хорошилова // Новая аптека. Аптечный ассортимент. – 2009. –№ 6. – С. 100–102.
6. Семенова, А. Г. Гигиена выращивания молодняка свиней с применением пробиотиков «Ветом-1.1.» и «Биоспорин» [Текст]: автореф. дис. … канд. вет. наук : 06. 02. 05 / Семенова Анна Геннадьевна. – 2011 – 136 с.
7. Блажнова М. В. Эффективность применения вермикулита сухостойным коровам и прибиотика биоспорина для лечения и профилактики диспепсии телят [Текст]: автореф. дис. … канд. вет. наук : 16. 00. 01 / Блажнова Марина Владимировна. – Екатеринбург, 2004. – 141 с.
8. Таранова Л. А. Динамика морфофункциональных показателей эндометрия коров в зависимости от методов лечения и характера воспалительного процесса в матке животных [Текст]: автореф. дис. … канд. вет. наук : 16. 00. 02 / Таранова Людмила Анатольевна. – 2000. – 156 с.
9. Гост Р-53434-2009 Принципы надлежащей лабораторной практики. – 2009. – 16 с.
10. Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских технологиях [Текст] / под ред. Н. Н. Каркищенко // М.: Профиль, 2010. – 358 с.
11. Положение о государственном ветеринарном надзоре в Российской Федерации [Текст]. – М., 2001. – № 295.
12. Каркищенко В. Н. Разработка методики оценки физической выносливости мелких лабораторных животных для изучения адаптогенной активности некоторых лекарственных препаратов [Текст] / В. Н. Каркищенко, Г. Д. Капанадзе, С. Е. Деньгина, С. Н. Станкова // Биомедицина. – 2011. – № 1. –
    С. 72–74.
13. Porsolt R. D. Depression: a new animal mode sensitive et antidepressant treatment [Теxt] / R. D. Porsolt, M. L. Pichon, M. Jalfre // Nature. – 1977. – Vol. 266. –
    P. 730–732.
14. Кучеров И. О. Длительные биологические ритмы в динамике мышечной работоспособности человека [Текст] / И. О. Кучеров ; в кн.: Кибернетика и вычислительная техника ; под ред. К. А. Иванова-Муромского. – Киев, 1971. –
    С. 79–95.
15. Богдасарян Р. А. Частота биоритмов – критерий раннего выявления патологии [Текст] : метод. рекомендации / Р. А. Богдасарян. – Ереван, 1980. – 55с.
16. Кондратьева И. А. Практикум по иммунологии : учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / И. А. Кондратьева, А. А. Яри­лин, С. Г. Егорова ; под ред. И. А. Кондратьевой, А. А. Ярилина. – М.: Академия, 2004. – 272 с.
17. Rollany H. Effect of beta-interferon on in vitro of mouse peritoneal macrophages text. H. Rollany, H. Degre // Acta Pathol. Microbiol.-Immunol. Scand. – 1982. Vol. 890. – N 6. – Рp. 389-395.
18. Фрейдлин И. С. Неспецифическая активация клеток фагоцитирующей системы препаратами липополисахаридов и полисахаридов микробного происхождения [Текст] / И. С. Фрейдлин, М. А. Кашкина, Т. С. Забелина, Г. Е. Аркадьева // Актуальные вопросы иммунологии. – Алма-Ата, 1981. – № 1. – С. 139–140.

Метки: Ветеринария и зоотехния

• Назад
• Вперед